Guia Procedimiento Experimental De Separacion De Fosfatasa Acida

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Química y Biología Departamento de
LABORATORIO 1 Separación de Proteínas por Cromatografía de Exclusión Molecular.
Introducción Para estudiar la función o las propiedades de una proteína, como por ejemplo su secuencia, actividad, o estructura, es de gran importancia obtenerla como una especie pura. Los métodos habitualmente utilizados en lapurificación de proteínas, se basan algunas de las características de éstas, incluyendo su tamaño, carga o capacidad de unión. El conjunto de métodos que tienden a separar proteínas provenientes de un extracto es denominado fraccionamiento, entre los que destacan las cromatografías en columna. Los métodos cromatográficos habitualmente utilizados en el estudio de proteínas son las cromatografías deexclusión molecular o filtración en gel, de intercambio iónico, de afinidad y el HPLC. En el presente práctico se nos presenta como objetivo la separación de proteínas contenidas en una mezcla, mediante una cromatografía de exclusión molecular, utilizando como fase estacionaria Sephadex G75. Una de estas proteínas es la fosfatasa ácida de germen de trigo.

Procedimiento Experimental. 1.- Preparación dela columna. Se montará una columna de Sephadex G-75. • • • • Coloque un pedazo de lana de vidrio en el fondo de la columna de vidrio. Cierre la llave de paso de la columna y llénela con agua destilada. Posteriormente, abra la llave de paso y deje escurrir el agua hasta llegar a la mitad de la columna. De esta forma evitará la formación de burbujas a la salida de la columna. Agregue la suspensiónde Sephadex G-75 y deje sedimentar. Posteriormente, abra el flujo de la columna y continúe agregando Sephadex hasta formar una columna empaquetada de 10 a 12 cm. Equilibre la columna haciéndole pasar 2 volúmenes de agua.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Química y Biología Departamento de Biología Dr. Pablo Nelson Hunt 2.- Sembrado y elución de la muestra. Se utilizarán dos muestras.La primera de ellas, una solución de Azul Dextrano, y la segunda una mezcla que contiene albúmina sérica de bovino (BSA; 2mg/mL), fosfatasa ácida de germen de trigo (2mg/mL), y citocromo C (1mg/mL). • • • • • Eluya el agua de la columna hasta que la superficie del gel esté a punto de secarse. Con una micropipeta agregue 500 µL de muestra. Eluya muy lentamente, hasta que la muestra haya ingresadocompletamente en el gel. Agregue agua a la columna. Comience la elución de la muestra, colectando fracciones de 1 mL en tubos eppendorf.

3.- Confección del cromatograma. En papel milimetrado, se confeccionarán los perfiles de elución de proteínas obtenido. • • • Mida la absorbancia de cada una de las fracciones colectadas a 280 y 550 nm, usando eluyente como blanco. Grafique Abs v/s número defracción. Interprete los resultados obtenidos, y guarde fracciones representativas para los máximos. No olvide guardar un mínimo como control negativo..

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Química y Biología Departamento de Biología Dr. Pablo Nelson Hunt

LABORATORIO 2 Determinación de la Concentración de Proteínas por el Método de Bradford
Introducción Se han descrito numerososmétodos que permiten determinar la concentración de proteínas, todos ellos presentan ventajas y desventajas. La elección del método dependerá de la naturaleza de la proteína, la naturaleza de los otros componentes en la muestra o la sensibilidad o sencillez deseadas. Los métodos más tradicionalmente usados se basan en diferentes propiedades químicas y físicas de las proteínas., siendo los principaleslos ensayos de Biuret, Lowry y Bradford. Este último se basa en la propiedad del colorante azul de coomassie G-250 de unirse a las proteínas, presentando un máximo de absorción a 595 nm. La coloración es proporcional a la concentración de proteínas, obteniéndose un comportamiento lineal en el rango de 0 a 30 µg de proteínas. Anteriormente, fue determinado mediante el método de absorción UV la...