HPLC

EL CROMATOGRAFO HPLC SHIMATZU
(Preparado por Mª José Reyes y Ramón Alajarín, a quienes agradecemos el esfuerzo) (21/03/03)
Introducción.
Este trabajo pretende sentar las nociones básicas para el empleo del HPLC Shimatzu que disponemos en el módulo II.
Este instrumento, a diferencia del que existe en el módulo I, permite trabajar en gradiente. De esta forma se pueden lograr con éxitoseparaciones utilizando mezclas variables de disolventes.
Los componentes básicos que constituyen el equipo son los que muestra la figura a continuación:


Nuestro equipo concretamente consta de:
-dos bombas: es importante saber que la bomba A es la situada a la izquierda y la B a la derecha para este caso en concreto.
-inyector automático: que permite la inyección de series de muestras ensecuencia. De esta forma, automáticamente y uno tras otro pinchará los viales que les hayamos indicado en la secuencia.
-detector: como se observa el detector pertenece a un equipo antiguo. Por tanto, sólo detecta a la longitud de onda indicada en la ventana.
-controlador: es la parte más importante del equipo. Para nuestro caso constituye el ordenador real y en él es donde se diseñan los métodos detrabajo, se controlan flujos y presiones y se realizan las secuencias.
-ordenador: en este equipo constituye una herramienta para el registro de datos ya que no disponemos del software para utilizarlo como controlador de todo el sistema.
Las bombas y el inyector automático disponen de un pequeño software. También disponen de una ventana, un teclado numérico y unas teclas de funciones especiales.Antes de empezar.
Hay que tener en cuenta que el equipo de HPLC es una herramienta muy sensible y, por tanto, hay que cuidar todo lo que se va a introducir en el HPLC:
- Muestras: todas las muestras se preparan con disolventes de alta pureza o grado HPLC y se deben filtrar con filtros de 0.4 Å.
- Eluyentes: deben filtrarse y desgasificarse (5 min. Mínimo) antes de su utilización. De estosprocesos dependerá la vida del equipo y las columnas, además de los resultados obtenidos.

Para encender el equipo se sigue el siguiente orden:
Bombas Inyector automático Detector Controlador Ordenador
Para apagar se sigue el orden inverso.

- Purga del sistema.
Se debe de purgar el sistema de conducciones antes de colocar la columna para evitar restosde otros eluyentes. De esta forma también evitamos las indeseables burbujas de aire en todo el sistema.
Para purgar el sistema hay que abrir las válvulas que tienen las bombas y el inyector automático a la derecha de las misma y pulsar la tecla azul PURGE . cada uno de estos sistemas contiene un tiempo programado de purga que no conviene cambiar. Si el sistema contiene todavía burbujas de aire,repetimos la operación. Una vez finalizada se cierra las válvulas de purga.
- Colocación de la columna.
El controlador dispone de una tecla azul act, pulsarla. De esta forma empezará a salir eluyente por donde está la conexión a la columna. Dejar salir un rato. La columna dispone de una etiqueta que además de indicar de qué tipo de columna se trata contiene una flecha con la dirección quedebe seguir el flujo. Colocar la entrada de la columna con la salida del inyector y esperar hasta que salga eluyente por el extremo superior. Conectar el final de la columna con la conducción al detector. Secar bien las uniones y esperar unos minutos para no detectar fugas.

Controlador.
Como comentábamos antes, el controlador se encarga del método para la inyección y de la secuencia con que seinyectan las muestras.
Un método en el controlador sirve para establecer:
A. Cuánto tiempo va a durar la inyección.
B. La Pmax. y Pmin. a la que va a trabajar la columna.
C. El flujo.
D. Y, lo más importante, el gradiente con el que va a trabajar la columna durante la inyección.
En la pantalla inicial del controlador, aparece un menú principal. Las ventanas más importantes son Sequence 0,...