HPLC

CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
(HPLC)

Cromatografía líquida de alta eficiencia
La fase móvil es líquida

Partición o reparto
Adsorción
Intercambio iónico
Exclusión molecular

Cromatografía líquida de alta eficiencia
Características y ventajas
Trabaja con partículas muy pequeñas (< 10 µm)
Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch
= libras por pulgada cuadrada, 1atm = psi/14.7)
Rápida
Picos angostos (alta eficiencia)
Separa compuestos no-volátiles o térmicamente
inestables

Esquema del equipo de HPLC
INYECTOR

PRE-COLUMNA

BOMBA
CÁMARA DE
MEZCLA
COLUMNA

DETECTOR

Fase móvil (solvente)
A diferencia de CG, en cromatografía líquida el solvente
por si solo puede modificar la selectividad de las
separaciones.
Solventes utilizados:solventes orgánicos,
agua/solventes miscibles, agua/soluciones reguladoras
Alto grado de pureza
Alto poder solubilizante de las muestras:
evitar precipitación en el sistema inyector o en la
columna. PELIGRO!! puede quedar el sistema
bloqueado o la columna estropearse irreversiblemente

Fase móvil (solvente)
Baja reactividad: con la muestra y/o FE
Compatibilidad con el detector utilizado(de absorción, de
luminiscencia, electroquímicos, espectrómetro de masa, etc.
Baja viscosidad

L⋅µ
−6
∆P = φ ⋅ η ⋅ 2 × 10
dp
Adecuado punto de ebullición

Fase móvil (solvente)
La fase móvil no debe contener gases disueltos
Reacciones entre los gases y los componentes de la muestra.
Las burbujas producen oscilaciones de presión → irregularidades en el
flujo → fluctuaciones en larespuesta del detector → cambio en la línea
base y/o señales parásitas (se afecta la reproducibilidad).
He

Tratamiento con He

Desgasificación

Sistema de desgasificación al vacío

Filtración

Elución isocrática vs elución con gradiente
Elución isocrática: solvente de composición constante.
Elución con gradiente: solventes de distinta polaridad. Se
varía la composición de la FM enforma continua o
escalonada.

Elución
isocrática

Elución con
gradiente

Elución isocrática vs elución con gradiente
Elución isocrática: solvente de composición constante.

B=acetonitrilo

Elución isocrática vs elución con gradiente
Elución en gradiente: solventes de distinta polaridad. Se varía
la composición de la FM en forma continua o escalonada.

¿CUANDO ES NECESARIO UNGRADIENTE?
Buena resolución pero
alto tiempo de análisis

Buen tiempo de análisis
pero baja resolución

COMPROMISO IDEAL

Sistemas de bombeo
Requerimientos
Generación de altas presiones (1000 - 6000 psi)
Flujo libre de pulsaciones
Caudales 0.1 – 10 mL/min
Componentes resistentes a la corrosión (acero
inoxidable, teflón)

Bomba recíproca o de movimiento alternado
etapa de aspiraciónetapa de descarga
hacia la
columna

pistón

fase móvil
Ventajas: pequeño volumen interno, resiste presiones > a
10.000 psi, permite elución con gradiente, caudales
constantes e independientes de la contrapresión de la
columna y la viscosidad del solvente
Desventaja: produce flujo pulsado (amortiguar)

Bomba reciprocante de doble pistón

Bomba isocrática marca WatersSistemas de inyección de muestra

Llenado del bucle
muestra

eluyente

Inyección de
muestra en columna

eluyente
columna

columna

Sistemas de inyección de muestra

Sistemas de inyección de muestra

Inyección manual versus inyección automática

> precisión

Precolumna

Composición similar a la columna cromatográfica
Elimina materia en suspensión y componentes de
la muestraque se unen irreversiblemente a la FE
Se usa para mejorar la vida de la columna. Se
reemplaza cuando se contamina.

Columna

Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente
de vidrio resistente
Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i.
Tamaño partículas de relleno: 5–10 µm
Columnas termostatizadas: en general se
trabaja a T ambiente. La T constante mejora el
cromatograma

Columna...