Hplc

Curso de Análisis Instrumental Instituto de Ingeniería Química Facultad de Ingeniería - 2007

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICACIA (HPLC)
Ampliamente utilizada Gran sensibilidad Determinaciones cuantitativas exactas

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICACIA (HPLC)

Determinación de compuestos no volátiles (alto Peso Molecular, iones metálicos) o termolábiles. Aplicabilidad asustancias de interés general (industria, salud, medioambiente). Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, etc.

Juan Bussi

Solventes como Fase Móvil
Interacciones químicas entre la muestra, la fase móvil y el relleno de la columna, determina el grado de migración y separación de componentes contenidos enla muestra. Compuestos con interacciones más fuertes con la fase móvil que con la fase estacionaria eluirán más rápidamente de la columna (tiempos de retención menores). La fase móvil puede ser alterada en el transcurso del análisis para manipular las interacciones de los componentes de la muestra con la fase estacionaria. •Elución Isocrática: composición constante de la fase móvil •Elución porgradiente: los distintos analitos son eluídos con incremento de la composición de la fase móvil en la fase orgánica. •Elución politíptica: se combinan varios tipos de técnicas.

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APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Polaridad creciente
Insoluble en agua No Polar No Iónico Polar 102 Adsorción
(Reparto en fase inversa)

Definiciones Coeficiente de distribución K = cS/cM Tiempo deretención: tM Velocidad lineal media v = u x ft Velocidad de migración u v=ux 1 1 + KVS/VM

Soluble en agua Iónico

Reparto
(Reparto en fase normal)

Intercambio iónico

PesoMolecular

10

3

104 Exclusión por tamaño (Penetrabilidad sobre gel)
106

105

(Filtración sobre gel)

Factor de capacidad de una especie A: k’A = KA VS/VM tR – tM k’A = tM

Distintos métodos soncomplementarios.

Eficacia de columnas para HPLC

Factor de selectividad para dos especies A y B (tR)B – tM α = KB/KA = k’B/k’A = (tR)A – tM Altura de plato teórico H = σ2/L Nº de platos teóricos N = L/H

Conceptos de Altura de Plato Teórico y factores que lo afectan como en otras cromatografias. H = A + B/u + (CS + CM) u (ecuación de Van Deemter) Velocidades lineales menores que en CG Altura deplato menor que en GC (1 orden de magnitud). Longitud de columnas menor (25 a 50 cm).

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Efecto del tamaño de partícula del relleno CS y CM ∝ dP2 Aumento de eficiencia con disminución del tamaño de partícula (tamaño usuales entre 2 y 10 µm

Ensanchamiento extracolumna
Debido a diferencias de velocidad entre distintas capas del líquido que se desplaza en tubos de inyección, de conexión ydetectores. Gradientes no se compensa por difusión. Hex = π r 2u 24DM Reducción del diámetro de tubos a menos de 2.5 mm.

Efecto del tamaño de muestra
Más notorio en Adsorción y Reparto

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Instrumentación
Elevadas presiones para alcanzar caudales necesarios. Equipamiento sofisticado y caro.

Recipientes para una o más fases móviles
De vidrio o acero de 0.2 a 1 L

Cámara de mezcla paradisolventes Ventajas de la elución con gradiente (relación variable de volúmenes de dos o más disolventes) Mejora de resolución en tiempos de análisis más cortos.

Sistemas de pretratamiento de fases móviles
Para eliminación de gases disueltos y sólidos en suspensión desgasificación por vacío calentamiento agitación inyección de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio). Filtros para polvo ypartículas sólidas en suspensión.

Sistemas de bombeo
Generación de presiones superiores a 6000 psi. Caída de presión en una columna: η: viscosidad ηLu ∆P = θ dP2

Método común: filtración a vacío a través de filtro millipore de tamaño de poro muy pequeño (eliminación de gases disueltos y sólidos en suspensión).

θ: parámetro adimensional (valor cercano a 500 para columnas bien empacadas)...