Microbio-logia ADN

Newsletter Microbial

http://www.microbial‐systems.com 

Núm.

3

Enero ‐ Febrero de 2009 

Informaciones sobre Análisis Microbiológicos por PCR  

La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR.
Mitos y realidades
“De los tres pasos Introducción 
En PCR, el ácido desoxirribonucleico (ADN) es
críticos que comel analito. Por tanto, una buena muestra impliponen elanálisis de ca siempre un correcto proceso de obtención de
esta molécula a partir de material biológico.
patógenos por
La extracción de ADN consta de una etapa de
PCR, la extracción lisis, que consiste en romper las estructuras
el
medio
de ADN es quizás que confinanotracitoplasma y liberar alimplica su
contenido y
de purificación, que
la
el más desconoci- retirada de la solución final de lamayoría de
elementos que pueden interferir en la PCR.
do... ”
“...las suspensiones
densas de bacterias
gramnegativas
pueden liberar su
ADN en condiciones bastante suaves... ” 

Lavado del pellet. Se realiza con alcohol
frío volviendo a centrifugarse

•

Recuperación. El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris tras ser
secado completamente.

La confirmación de lapresencia de ADN se
lleva a cabo mediante electroforesis en un gel
de agarosa i posterior tinción con bromuro de
etidio y observación con luz UV o directamente
al espectrofotómetro mediante espectro de
absorción de 200 a 350 nm. El ADN purificado
De los tres pasos críticos que componen el aná- se puede cuantificar con un espectrofluorímetro
lisis de patógenos por PCR (Fig. 1), la extrac-mediante el uso de fluoróforos específicos
ción de ADN es quizás el más desconocido y (Picogreen®, Molecular Probes)
sobre el que más control podemos ejercer.
El paso 3 puede realizarse con la ayuda de mi-

Enriquecimiento

Extracción ADN

Detección PCR

Figura 1. La extracción de ADN es un paso clave en los análisis microbiológicos por PCR 

La extracción del ADN de las células o virusdonde se halla confinado es un paso previo en
muchos procedimientos analíticos y diagnósticos.

Etapas en la extracción de ADN

“La incorporación
de controles internos de amplificación en los kits
permite el control
del nivel de inhibición de las reacciones...”

•

nicolumnas equipadas con una membrana de
sílica que retiene específicamente el ADN permitiendo el paso de las moléculas ysales que
acompañan la reacción de lisis. Finalmente se
lava con alcohol y se eluye el contenido

Los pasos necesarios para una correcta extrac- Inhibidores de la PCR 
ción y purificación del ADN mediante un proce- Se trata de substancias que interfieren con las
dimiento químico son:
ADN polimerasas termoestables ya sea mediante el bloqueo directo total o parcial de su activi1. Lisis de lascélulas o virus. Las sales caotró- dad catalítica o mediante la unión directa al
picas ayudan a romper la estructura tridi- ADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas
mensional de macromoléculas como las substancias interaccionan con los iones Mg2+
proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un Tabla 1. Principales substancias inhibidoras de la PCRdetergente como el SDS es necesaria a meInhibidor
Origen
nudo para eliminar las membranas.
2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición
de una proteasa. La fracción proteica puede
precipitarse mejor con la ayuda de sales
como el acetato de amonio o el acetato
sódico.
3. Purificación. Consta de 3 fases:

•

Precipitación del ADN. El ADN es insoluble enalcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o isopropanol i recuperar
mediante una centrifugación. El alcohol
del sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente.

‐ 1 ‐ 

Sales biliares

Heces

Polisacáridos complejos

Heces, material vegetal

Colágeno

Tejidos

Grupo hemo

Sangre

Ácidos húmicos

Suelo, material vegetal

Melanina y eumelanina

Pelo,...