PCR_Laboratorio

Introducción

Cada organismo que vive en el planeta está codificado por los genomas [1], los que contienen la información biológica de cada uno de estos seres vivos. Tales genomas están compuestos por DNA, siendo este, el portador de la información genética que es utilizada por cada organismo en su desarrollo y su funcionamiento [1]. Generando un enfoque muy importante en el estudio querealiza la biología molecular; determinar la función de la molécula de DNA. Gracias a lo cual han nacido nuevas técnicas para poder manipular el DNA. En ocasiones, para realizar estas técnicas se necesita replicar esta macromolécula y para lograr este objetivo se realiza un proceso llamado Polymerase Chain Reaction (Reacción en Cadena de la Polimerasa; PCR por sus siglas en inglés), el cual permite alos investigadores tener millones de copias en un tiempo aproximado de dos horas de una molécula de ADN específica [2]. Para comprobar que los fragmentos de ADN obtenidos desde este proceso son del tamaño que se solicitaba, se deposita en un gel (agarosa para el presente práctico) junto con una muestra de tamaño ya conocido, llamado marcador de peso molecular y se compara el paso a través del gel,a este método se le denomina electroforesis.
Objetivos
1. Reconocimiento de DNA y visualización de fragmentos de DNA.
2. Entender los fundamentos físicos, químicos y biológicos que existen detrás del método y evidenciarlos de forma empírica.
3. Reconocer y aprender a usar los instrumentos de laboratorio involucrados en el proceso de extracción y de electroforesis.

Materiales y métodos
Enesta primera etapa, se utilizó un Kit DNAgenotek (Anexos. Imagen N°1), para el cual se requiere una muestra de 2 ml de saliva la cual es mezclada con el buffer que el Kit contiene. Posteriormente, se incuba durante 1 hora en un baño termorregulado a 50 °C, para luego, verter los 4,5 ml de mi muestra en un tubo de 15 ml a la cual se le agregan 180 µl de PT-L2P, incubando en hielo durante 10minutos (Anexos. Imagen N°2).
Con el propósito de reunir los organelos de mayor peso molecular en el fondo del tubo, centrifugamos a temperatura ambiente durante 10 minutos a 4.000 g. Luego de esto, eliminamos el sobrenadante por suspensión del tubo, con el fin de disponer sólo de las células extraídas. Al sedimento recolectado le agregamos 5,4 ml de etanol absoluto, observando que se generan 2 fases,junto con la aparición de delgadas hebras de apariencia cristalina, que corresponde a la estructura fibrilar que la precipitación e los ácidos nucleicos adoptan en el espacio (Anexos. Imagen N°3). Luego se mezcla por inversión, proceso lento y cuidadoso para evitar formar algún tipo de burbuja que pudiera interferir en el procedimiento. Y a continuación, incubamos la suspensión nuevamente atemperatura ambiente durante 10 minutos. Durante otros 10 minutos centrifugamos a temperatura ambiente y a máxima velocidad, eliminando el sobrenadante. Posterior a esto, el DNA se lava agregando 1 ml de etanol al 70% e incubando durante 1 minuto a temperatura ambiente, con el fin de sacar la sal y el etanol posible. Luego, repetimos la centrifugación a máxima velocidad durante 1 minuto y a temperaturaambiente. Para finalmente descartar todo el sobrenadante utilizando una micropipeta p1000 y depositando en un tubo, el cual dejamos secando por 5 minutos. Resuspendiendo el DNA en 500 µl de agua libre de nucleasas durante 30 segundos.
A continuación, en la segunda etapa se incuba el DNA por 1 hora a 50 °C, con la finalidad de descongelar nuestra muestra y liberar el DNA. Muestra que paradeterminar su concentración y pureza será expuesta a un espectrofotómetro, y para identificar la integridad del DNA purificado se le realizará una electroforesis en geles de agarosa
Para esto, pesamos 0,8 de agarosa, para luego mezclar con 100 ml de tampón 1x TAE, el que posteriormente es enfriará hasta 55 °C en un horno microondas. A continuación se deposita en una bandeja formadora de gel ubicando...