separando organelos

Experimento Clásico

5.1

SEPARANDO ORGANELOS

E

n los años 1950 y 1960, los científicos utilizaron dos técnicas para estudiar

organelos celulares: microscopía y fraccionamiento. Christian de Duve estuvo
a la cabeza del fraccionamiento celular. En la década de 1950, utilizó la
centrifugación para distinguir un nuevo organelo, el lisosoma, a partir de
fraccionamientos previoscaracterizo: el núcleo, la fracción mitocondrial y los
microsomas. Poco tiempo después, utilizó la centrifugación de equilibrio de
densidad para descubrir otro organelo.

Antecedentes
Las células eucariontes son altamente organizadas y compuestas por estructuras celulares conocidas como organelos
que realizan funciones específicas. Aunque la microscopía
ha permitido a los biólogos describir laubicación y el
aspecto de diferentes organelos, es de uso limitado en el
descubrimiento de la función de los organelos. Para ello,
los biólogos celulares se han basado en una técnica conocida como fraccionamiento celular. Aquí, las células se rompen, y los componentes celulares se separan en función de
su tamaño, masa y densidad, utilizando una variedad de
técnicas de centrifugación. Loscientíficos pudieron aislar y
analizar los componentes celulares de diferentes densidades, llamadas fracciones. Usando este método, los biólogos
habían dividido la célula en cuatro fracciones: fracción
nuclear, fracción mitocondrial, fracción microsómica y
fracción soluble.
de Duve fue un bioquímico interesado en la localización
de enzimas metabólicas subcelulares. Él ya había completado un grancuerpo de trabajo sobre el fraccionamiento de
las células del hígado, en el que había determinado la localización de numerosas enzimas subcelulares. Mediante la
localización de estas enzimas en fracciones celulares especificas, pudo comenzar a aclarar la función del organelo.
Ha señalado que su trabajo se basó en dos hipótesis: el
"postulado de la homogeneidad bioquímica" y "el postulado de lalocalización." En resumen, estas hipótesis propone
que toda la composición de una población subcelular contendrá las mismas enzimas, y que cada enzima se encuentra

en un sitio discreto dentro de la célula. Armado con estas
hipótesis y la poderosa herramienta de la centrifugación, de
Duve subdivide la fracción mitocondrial. En primer lugar,
identificó a la fracción ligera mitocondrial, que secompone
de las enzimas hidrolíticas, que ahora se sabe componen el
lisosoma. Luego, en una serie de experimentos que se describen aquí, identificó otra fracción subcelular discreta, que
él llamó peróxisoma, dentro de la fracción mitocondrial.

El Experimento
de Duve estudio la distribución de enzimas en células de
hígado de ratas. Altamente activo en energía metabólica,
el hígado contieneun número de enzimas utilizables para
estudio. Para buscar la presencia de varias enzimas durante
el fraccionamiento, se basó en pruebas conocidas, llamadas ensayos enzimáticos, para la actividad enzimática. Para mantener la máxima actividad de la enzima, tuvo que
tomar precauciones, que incluyó realizar todos los pasos
de fraccionamiento a 0°C, porque el calor desnaturaliza
las proteínas,pudiendo comprometer la actividad enzimatica.
de Duve utilizó centrifugación de velocidad zonal para
separar los componentes celulares, por sucesivos pasos de
centrifugación. Removió el hígado de rata y lo trituró
separado por homogenización. Posteriormente, la preparación cruda de células homogenizadas fue sometida a centrifugación a velocidad relativa baja. Este paso inicial separa

Lacentrifugación de equilibrio gradiente-densidad puede
ser realizada utilizando un número de diferentes gradientes, incluyendo sacarosa y glicógeno. Además, el gradiente puede ser hecho en agua o “agua pesada”, que contiene
el isotopo de hidrogeno deuterio, en lugar de hidrogeno. En
su experimento, de Duve separó la fracción mitocondrial
rica del preparado por centrifugación de velocidad zonal...