Técnicas Ultraestructurales

Microscopio Electrónico (Dr. Ernst Ruska 1931)
Técnicas ultraestructurales
Nuevos métodos de estudio
La inmunocitoquímica y la inmunoflourescencia, están fundamentadas en la especificidad de la reacción entre un antígeno y un anticuerpo, el anticuerpo puede estar acoplado a una partícula de oro (inmunocitoquímica) o a una molécula flourescente (inmunoflourescencia), y se utiliza para reconocera nivel subcelular una sustancia química en el interior de la célula a partir del patrón de distribución de un compuesto químico.
La citometría de flujo es una microespectrometria acoplada a un sistema de visualización digital, cuentifica la absorción de luz por parte de las células y diagnostica los valores del DNA en tumores cancerígenos.
La patología molecular permite detectar anormalidadescromosómicas asociadas con desordenes genéticos.
El microscopio electrónico, permite analizar los constituyentes subcelulares de las células normales y/o patológicas.
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Microscopia electrónica
Microscopio óptico vs microscopio electrónico; el microscopio óptico puede distinguir detalles con una resolución de 0,2 micrones y su poder de resolución está dado por su longitud de onda, y el poderde resolución del microscopio electrónico es de 0,002 nm (nanómetros)
El microscopio electrónico resuelve la estructura final de la célula, y el límite de resolución impuesto por la longitud de onda de la luz visible puede ser reducido utilizando electrones en vez de fotones. Ya que; los electrones poseen una longitud de onda menor que la longitud de onda de la luz visible, la longitud deonda disminuye a medida que aumenta la velocidad de los electrones, y los electrones pueden ser acelerados usando voltaje de aceleración equivalente a 10.000 voltios.
El poder de resolución del microscopio electrónico es de 0,002 nanometros, pero por problemas de preparación de la muestra es de 2 nanometros. (1 nanómetro (nm) representa una milésima parte de 1 micra, y 1 Angströn (Å) equivale a0,1 nanómetro (nm)
Unidades básicas del microscopio electrónico:
• Unidad de alta tensión: es la responsable de generar el alto voltaje necesario para obtener un rayo electrónico de corta longitud de onda.
• Sistema de vacío: Son unas bombas difusoras de aceite/rotatoria mecánica. Se necesita ya que los electrones se desplazan solo en el vacío.
Columna del microscopio electrónico detransmisión.
• Producción de electrones; cátodo, ánodo. (Filamento de tungteno, voltaje de aceleración)
• Lentes electromagnéticas; condensadoras (agrupar los electrones), objetivo (se forma la imagen), intermedia y proyectoras (mejora la resolución de la imagen).
• La formación de la imagen se da en la pantalla de visualización.
Tipos de microscopio electrónico; de transmisión (imágenes enforma bidimensional y por transiluminación) y de barrido (permite observar imágenes tridimensionales y objetos completos, pero posee menor resolución en comparación con el de transmisión)
Todos los tejidos DEBEN ser fijados y seccionados, la fijación mantiene la integridad de las células al evitar su autolisis o destrucción, y en el caso de las técnicas ultraestructurales se necesita una fijacióninmediata; y permeabiliza las células a sustancias contrastantes, y seccionados con la elaboración de cortes, por lo tanto los tejidos deben ser blandos por lo que deben ser incluidos (meter el material en parafina para seccionar la célula).
Las muestras biológicas requieren una preparación especial para ser estudiadas con el microscopio electrónico; célula -> exposición al vacío -> secado ->distorsión -> fijación.
Condiciones básicas de la fijación ultraestructural
• Extracción de tejidos (in vivo)
• Tamaño del tejido a fijar (1 mm 3)
• Temperatura del fijador 0°C
• Tiempo de duración de la fijación 1 – 2 horas
• pH del líquido fijador 7,4
• Cantidad de fijador: 50 veces
• Presión osmótica y tonicidad del líquido fijador 0,34 M
• Concentraciones de los fijadores 2 – 4 %
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