Tarea Diagnostico Molecular

Capítulo 9. Diagnóstico Molecular.
1. ¿En que consiste la técnica ELISA y cuál es su uso?

Se utiliza como método de diagnostico para determinar si un anticuerpo se ha unido a su antígeno objetivo. De forma general, consiste en agregarle a la muestra a analizar un marcador especifico del anticuerpo para que se una a la molécula objetivo, posteriormente después de lavar la muestra, se leagrega un segundo anticuerpo que se une específicamente a ese primer anticuerpo que puede catalizar una reacción que convierte un sustrato incoloro en uno colorido; finalmente se lava la muestra para remover sobrante del segundo anticuerpo y se le agrega un sustrato para que reaccione y pueda contabilizarse el producto que cambia de color.
4 Fases de la técnica ELISA:
Conjugacion del anticuerpo odel antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda servalorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica.
Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenosse realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa poco antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa demasiado antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa.
Formación de una o más capas deinmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido ala placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, noocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad parainteraccionar, dando igualmente falsos negativos.
Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
Como la principal característica de este sistema es la unión específica delanticuerpo primario al sitio objetivo, si la molécula objetivo fuese una proteína, entonces una preparación purificada de esa proteína se usara para generar los anticuerpos que serán usados para detectar la molécula objetivo. La mezcla de anticuerpos resultante (preparación policlonal) contiene diferentes anticuerpos que cada uno puede unirse a diferentes determinantes antígenos de la molécula objetivo...