TECNICO SUPERIOR UNIVERSITARIO

An Efficient mRNA-Dependent Translation System
from Reticulocyte Lysates
Un sistema de traducción del ARNm Dependiente Eficiente
de reticulocitos lisados
Hugh R. B. PELHAM and Richard J. JACKSON
Department of Biochemistry, University of Cambridge
(Received April 1, 1976).

Un método simple se describe para la conversión de un extracto estándar libre de células de reticulocitos de conejo( lisado ) en un sistema de síntesis de proteínas ARNm - dependiente. El lisado se incuba con CaCl ,
y la nucleasa microcócica , y luego el exceso de etilenglicol -bis ( 2 - aminoetiléter ) - N , N' - tetraacético
ácido se añade para quelar el Ca2 + y inactivar la nucleasa . Lisados ​​tratados de esta manera tienen insignificante
actividad incorporación de aminoácidos endógena , pero el 75 %de la actividad del lisado original se puede
recuperado por la adición de globina ARNm . La eficiencia de la utilización de ARNm añadido y la
sensibilidad del sistema son ambos muy alta . No hay actividad nucleasa residual podría ser detectada , y el
ARNt es funcionalmente intacta . Se ha demostrado que varias especies diferentes de ARNm para ser traducido
eficiente en productos de tamañoestándar de peso molecular esperado hasta aproximadamente 200.000 , y hay
hay acumulación detectable de productos de proteínas incompletas . La traducción eficiente de ARN
a partir de dos virus de plantas (virus del mosaico del tabaco y virus del mosaico del caupí ) requerido ARNt heterólogo.
La proteína libre de células eucariotas más eficiente
sistema de síntesis disponible es la de reticulocitosno fraccionada
lisado [ l ] . Exógenos mRNA también es traducible
en este sistema , pero el hecho de que ya es
saturado con ARNm endógeno significa que el
Agregado ARNm se traduce sólo en la medida en que se
puede competir con el ARNm endógeno . Un más
desventaja es que los ARNm no pueden ser añadidos
ensayó mediante simple incorporación de aminoácidos radiactivos
métodos , pero sólomediante el análisis de la radiactivo
productos de proteína sintetizada , y esto a su vez exige
que el ARNm en los códigos de ensayo para una proteína que
se resuelve fácilmente de las proteínas sintetizadas en
ARNm endógeno de reticulocitos .
Sería claramente una ventaja si el reticulocitos
lisado podría ser tratado de alguna manera para eliminar o
inactivar el ARNm endógeno mientras queconserva
la actividad completa de todos los otros componentes necesarios
para la síntesis de proteínas. Los intentos de lograr este objetivo mediante la
fraccionando el lisado para eliminar el ARNm endógeno
han dado lugar a sistemas que , incluso cuando está saturado
con ARNm exógeno , son considerablemente menos activos
que el lisado no fraccionada inicial [ 2 ] . Dos intentos
se han hecho paraexplotar el mayor
nucleasa sensibilidad de ARNm en oposición a tRNA y
ARN ribosómico mediante el uso de bajas concentraciones de
ribonucleasa pancreática para destruir ARNm endógeno
Abbreuiatioizs . TMV , virus de mosaico del tabaco : EGTA , etileno -
Enzimas . La creatina quinasa ( EC 2.7.3.2 ); nucleasa micrococcal
glicol -bis ( 2 - aminoetiléter ) - N , N'-tetraacético .
(CE 3.1.4.7 ) ;ribonucleasa pancreática (CE 3.1.4.22 ) .
[3,4 ] , pero la eliminación de la nucleasa residual ha hecho necesario
fraccionamiento del lisado con todas las desventajas
que ello conlleva. Se nos ocurrió que
podría ser ventajoso usar nucleasa microcócica
en lugar de ribonucleasa pancreática para destruir endógena
mRNA desde nucleasa micrococcal requiere
Ca2 + [ 5 ] y por lo tanto puede serinactivada por la adición
de agentes quelantes selectivos tales como etilenglicol -
bis ( 2 - aminoetiléter ) - N , N'-tetraacético
( EGTA ) . En este trabajo mostramos que los lisados ​​de reticulocitos
que se han preincubado con de CaCl , y micrococcal
nucleasa , y a continuación, suplementado con exceso
EGTA tienen la síntesis de proteína endógena insignificante
actividad todavía...