Tema012

Tema: 12. Obtención y análisis de datos cinéticos.
1. Integración de la ecuación de Michaelis-Menten:
1.1. Orden cero de reacción
1.2 . Orden uno de reacción
1.3. Orden mixto de reacción

2. Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten:
2.1. Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk.
2.2. Representación de Hanes
2.3. Representación de Eadie-Hofstee.
2.4. Representación linealdirecta o representación de Einsenthal y
Cornish-Bowden

1. Integración de la ecuación de Michaelis-Menten:
Estudio de acuerdo con el orden de reacción
Dependencia de la velocidad con respecto a la [S]

1.1. Orden cero de reacción
 dS V max dt
St So  V max t

v 

v V max

S>>>Km
10 veces la Km

Integrando entre So y St y entre 0 y t

 E01   V max 1
 E02  V max 2

La razón de lascantidades de enzima es proporcional a la razón de velocidades
máximas o de las actividades enzimáticas obtenidas experimentalmente
Comparar cantidades de una misma enzima de un tejido o en
circunstancias metabólicas diversas, diferenciación, patologías, etc

Km   S 

dS
S
V max V max
dt
S

Permite comparar cantidades totales de enzima
Vmax1= kcat [E01]
Vmax2= kcat [E02]

S

1.2. Orden uno dereacción
v 

dS
S
V max
dt
Km

v V max

 S
Km   S 

S<<< A concentraciones 1/10 Km

dS V max t Integrando entre S0 y St


dt

So S
0
Km
V max
  ln St  ln So 
t
Km
So V max
ln

t
Obtener el valor de Vmax/Km
St
Km
St

St So  e

V max
t
Km

Conociendo cantidad incial de
enzima [Eo] puede obtenerse la
constante de especificidad (kcat/Km)

1.3. Orden mixto de reacción
dS
S
V maxdt
Km  S
Km  S
 dS
V max dt
S
St dS
St
t
 Km 
  ds V max dt
So dt
So
0
St
 Km ln
  So  St  V max t
So

v V max

S ≈ Km

S
Km   S 

v 

1 So
ln
t St

Dividiendo los dos términos por Km y por t

1 So V max
1 ( So  St )
ln


t St
Km
Km
t

1
m
Km

( So  St )
t

Linearización de la ecuación
integrada de M-M a S ≈ Km

Estudiando el avance de una sola reacción cuando
estamosen orden mixto se pueden obtener:
Vmax y Km

Vmax

2. Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten
Lo primero es obtener los correspondientes parámetros cinéticos.
Para obtener los parámetros cinéticos de una enzima lo que solemos hacer
es obtener la velocidad inicial, v, a diferentes concentraciones de S.

v

Vmax

v V max

[S]
v frente a [S]

S
Km   S 

 Imaginemos que estamosestudiando una reacción S  P
catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L-1)
vo(mol L-1 min-1)
0,30
0,57
0,50
0,85
0,75
1,18
1,50
1,82
3,00
2,50
7,50
3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la
representación V  [S].
Calcúlenlo ahora y escriban sus resultados en la
pizarra.

Analicen los datos.
¿Alguna conclusión?
Como acabamos de ver larepresentación de v frente a [S]
es poco útil para estos fines, debido a:
- la dificultad para dibujar con precisión una hipérbola
rectangular
- la dificultad para encontrar las asíntotas (Vmax), de
manera correcta, y consecuentemente para calcular Km

* Estas dificultades, fueron ya tenidas en cuenta por Michaelis y
Menten, quienes intentaron representar v frente a log[S]. Esta
representación tieneciertas ventajas, aparte de su valor histórico,
pero debido a su poco éxito, en la bioquímica moderna, no
comentaremos nada más sobre ella.

Para resolver este problema, y poder calcular Vmax y Km con
mayor fiabilidad, se han propuesto varios procedimientos o
métodos. La mayoría de ellos basados en la linealización de la
ecuación de Michaelis-Menten
Quizás las tres representaciones más usadassean:
- Representación de Linenweaver-Burk o de dobles inversos
(1/v  1/[S])
- Representación de Hanes ([S]/v  [S])
- Representación de Eadie-Hofstee (v  v/[S])
Además de estas tres representaciones, basadas en la
linealización de la ec. de M&M, existe una curta basada en la
representación directa v  [S], o representación de Einsenthal y
Cornish-Bowden.

2.1.Representación de dobles inversos o...

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