Tincion Gram

TINCION DE ZIEHL NEELSEN
La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microrganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl, un bacteriólogo y Friedrich Neelsen, un patólogo.
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos(ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia.La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cualtambién facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

TECNICA
Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas.
VARIANTE HISTOLOGICA
Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina. Los reactivosnecesarios para su realización son los siguientes:
ácido periódico 58%
carbol fucsina de Ziehl culina (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado:
0,5 g fucsina básica
50 cc agua destilada
5 cc etanol absoluto
28,5 g cristales de fenol derretidos
hematoxilina
alcohol ácido 1%:
alcohol de 35º
ácido clorhídrico
El procedimiento es el siguiente:
desparafinar e hidratar los cortesácido periódico 5%, 10 min
lavar con agua destilada
fucsina fenicada, 15 min
decolorar en alcohol ácido al 50%
lavar con agua destilada
hematoxilina, 10 min
azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio
deshidratar, aclarar y montar preparaciones

RESULTADOS
BAAR: rojo.
Núcleos: azul semiamarillo.
VARIANTE CLASICA O “EN CALIENTE”
Ésta y la siguiente variantes son parapreparaciones citológicas.
Hacer un frotis de la muestra.
La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción.
Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos
hacia arriba. Nunca tiña más de12 portaobjetos a la vez.
Dejar el frotis sobre el puente de tinción.
Aplicar fucsina-fenicada.
Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este período.
Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).
Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared celular de la bacteria. No dejeque hierva o se seque el colorante.
Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.
Decolorar con alcohol-ácido.
Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetosdurante 7 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos.
Aplicar azul de metileno (1 minuto).
Aplique la solución de contraste, azul de metileno,...