Tortero

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Practicas de PROCESOS bioquimicOS Y METABOLICOS

4. HIDRÓLISIS ENZIMATICA Y CUANTIFICACION DEL GLUCOGENO HEPATICO ESQUEMA - Introducción - Fundamento teórico: El glucógeno como reserva energética Metabolismo del glicógeno hepático Glucogenosis La degradación del glucógeno por la α-amiloglucosidasa Determinación colorimétrica de la glucosa -Procedimiento práctico: Materiales y reactivos Procedimiento experimental - Cálculos y análisis de los resultados obtenidos

I. INTRODUCCIÓN En esta práctica se llevará a cabo la degradación enzimática del glucógeno empleando la α-amiloglucosidasa, una enzima que degrada totalmente el glucógeno. La glucosa total obtenida por hidrólisis se determinará mediante una reacción enzimática (Glc oxidasa /POD), que da lugar a un sustrato coloreado cuya concentración se puede medir por espectrofotometría. Como sustrato inicial se utilizará glucógeno extraído de ratas normales y diabéticas, con el fin de comparar los resultados obtenidos en dos situaciones fisiológicas diferentes. La finalidad última de esta práctica es comprobar, mediante un ejemplo práctico, la capacidad del hígado para adaptarse adiversas situaciones metabólicas intentando mantener el aporte energético a otros tejidos.

Verónica González Núñez

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II. FUNDAMENTO TEORICO IIa. El glucógeno como reserva energética El glucógeno es el polisacárido de reserva de células animales, formado por unidades de glucosa unidas entre sí mediante enlaces α 1 4 y con ramificaciones en α 1 6 cada 4 - 6 residuos. El glucógeno posee unextremo reductor unido a la proteína glucogenina por un residuo de Tyr y varios extremos no reductores en los que actúan las enzimas responsables de la biosíntesis y degradación de este polisacárido. El glucógeno se encuentra en el músculo (14 g/Kg = 400 g totales) como reserva energética propia, ya que carece de la enzima glucosa-6 fosfatasa, y en el hígado (65 g/Kg = 100 g totales) como reservapara el mantenimiento de la glucemia. En situaciones de ayuno, el glucógeno hepático puede mantener la glucemia durante 12-14 h. El glucógeno es una forma más eficiente de almacenamiento energético que la propia glucosa, ya que ejerce una menor presión osmótica y al estar menos hidratado, ocupa menos espacio. En comparación con los lípidos, la glucosa puede ser metabolizada en condicionesanaerobias y es el combustible universal, ya que determinados tejidos como el cerebro sólo pueden utilizar glucosa* para obtener energía en forma de ATP. (*) excepcionalmente, el cerebro también puede utilizar cuerpos cetónicos como fuente de ε.

IIb. Metabolismo del glucógeno hepático La glucogenolisis ó degradación del glucógeno es un proceso muy rápido, ya que se lleva a cabo sobre los extremos noreductores. En este proceso actúan tres enzimas: la glucógeno fosforilasa, la oligo α 1,4 1,4 glucan-transferasa o enzima desramificante y la amilo α 1 6 glucosidasa. Los productos finales de la glucogenolisis son la Glc1P y Glc, que se transforman en Glc6P; en el hígado, la Glc-6-fosfatasa transforma la glucosa fosforilada en glucosa, que se libera a la sangre para mantener la glucemia. Labiosíntesis del glucógeno es realizada por la glucogeno sintasa a partir de UDP-Glc (forma los enlaces α 1 4). Las ramificaciones son introducidas por la enzima ramificante ó glucosil 4,6 4 entre dos Glc y transfiere 5 - 7 Glc sobre una Glc central, transferasa (rompe el enlace α 1 formando un enlace α 1 6).

Verónica González Núñez

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El metabolismo del glucógeno está regulado por sistemashormonales como el de la adrenalina, insulina y glucagón. Estas hormonas desencadenan cascadas de señalización intracelular en las que intervienen proteín-kinasas y proteín-fosfatasas. Los procesos de fosforilación y desfosforilación regulan la actividad de diversas enzimas, tales como la glucógeno fosforilasa y la glucógeno sintasa.

IIc. Glucogenosis Se conocen con el nombre de glucogenosis...