200910
Páginas: 10 (2488 palabras)
Publicado: 26 de enero de 2016
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL
Profesores: Alfredo Uribe – Pilar Murillo Período: 201120
Prácticas de laboratorio No. 2 y No. 3
ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN: APLICACIÓN EN LOS ESPECTROS DE ABSORCIÓN Y CUANTIFICACIÓN COLORIMÉTRICA: PROTEÍNAS TOTALES Y HEMOGLOBINA.
Figura No.1. Radiación Electromagnética.La mayoría de las mediciones en experimentos en Bioquímica se realizan en el ultravioleta cercano y visible.
1. INTRODUCCION
Un buen número de procedimientos experimentales en Bioquímica incluyen la cuantificación o caracterización de un compuesto o grupos de compuestos que hacen parte de una mezcla de trabajo. Quizás la técnica mas usada para estimar la concentración de dichos analitos es laespectroscopia de absorción.
El fundamento de este proceso descansa sobre la base de que al hacer incidir un haz de luz a una longitud de onda determinada previamente, seleccionada por un monocromador (filtros, primas o redes de difracción), a través de una solución (preferiblemente coloreada) se generará un proceso de absorción directamente proporcional a la concentración de la solución problema(Ver figura No. 2).
Probablemente, cuando se estudian metabolitos intermedios del metabolismo (Ej: Lactato, Piruvato, Productos finales de beta-oxidación de ácidos grasos) que no son coloreados, es necesario que algunos de los procesos experimentales sean acoplados a reacciones cuyo resultado final sea un pigmento que absorba en la región visible.
Estas reacciones son generalmente de una granespecificidad y muy sensibles hasta el punto de poder detectar cantidades de sustancia problema en concentraciones del orden de microgramos/litro. La principal ventaja de los procedimientos espectrofotométricos (Ver Figura No.2), es que en la mayoría de los casos, no necesitan el aislamiento de la sustancia por técnicas de separación para su cuantificación sino que permiten su medida aún al estaren mezcla con otras sustancias.
Es importante recordar que la absorbancia como tal no es una cantidad medible directamente, ella se obtiene por el cálculo matemático de los datos de la transmitancia (Recuerda usted el viejo truco? A= 2 - Log%T). Siguiendo este concepto, cuando la concentración de un compuesto en solución aumenta: más luz es absorbida por la sustancia, menos es trasmitida y porlo tanto, menos luz llega al detector. Pero para dar mas claridad a este concepto se siguen dos normas fundamentales que fueron claramente definidas por los señores Lambert y Beer.
Ley de Lambert y Beer:
La concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la energía radiante transmitida.
Si laconcentración de un compuesto es constante y la longitud del camino que la luz debe atravesar en la solución se duplica, el efecto sería el mismo que el que se obtiene al duplicar la concentración del analito en la solución, en razón a que habrá el doble de moléculas en el camino que atraviesa el haz de luz. De hecho, la longitud del camino óptico es directamente proporcional a la absorbancia.Limitaciones: (Desviaciones a la ley de Beer)
Se miden concentraciones muy elevadas (perdida de linearidad).
La energía de la radiación incidente no es monocromática.
Existe una pobre diferencia entre blanco y muestras.
Se filtra luz parásita por los dispositivos de detección.
Se utilizan celdas de baja calidad, cuyas paredes no son paralelas (efecto de aberración cromática).
INSTRUMENTAL
Figura No.2 Elementos de un espectrofotómetro de haz simple.
Los equipos utilizados para la cuantificación de sustancias químicas, normalmente tienen los siguientes componentes básicos:
1. Fuente estable de energía radiante
2. Selector de longitud de onda
3. Portacubeta
4. Detector de señal
5. Dispositivo para leer la información enviada por el detector
Existen dos tipos de selector de longitud de...
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL
Profesores: Alfredo Uribe – Pilar Murillo Período: 201120
Prácticas de laboratorio No. 2 y No. 3
ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN: APLICACIÓN EN LOS ESPECTROS DE ABSORCIÓN Y CUANTIFICACIÓN COLORIMÉTRICA: PROTEÍNAS TOTALES Y HEMOGLOBINA.
Figura No.1. Radiación Electromagnética.La mayoría de las mediciones en experimentos en Bioquímica se realizan en el ultravioleta cercano y visible.
1. INTRODUCCION
Un buen número de procedimientos experimentales en Bioquímica incluyen la cuantificación o caracterización de un compuesto o grupos de compuestos que hacen parte de una mezcla de trabajo. Quizás la técnica mas usada para estimar la concentración de dichos analitos es laespectroscopia de absorción.
El fundamento de este proceso descansa sobre la base de que al hacer incidir un haz de luz a una longitud de onda determinada previamente, seleccionada por un monocromador (filtros, primas o redes de difracción), a través de una solución (preferiblemente coloreada) se generará un proceso de absorción directamente proporcional a la concentración de la solución problema(Ver figura No. 2).
Probablemente, cuando se estudian metabolitos intermedios del metabolismo (Ej: Lactato, Piruvato, Productos finales de beta-oxidación de ácidos grasos) que no son coloreados, es necesario que algunos de los procesos experimentales sean acoplados a reacciones cuyo resultado final sea un pigmento que absorba en la región visible.
Estas reacciones son generalmente de una granespecificidad y muy sensibles hasta el punto de poder detectar cantidades de sustancia problema en concentraciones del orden de microgramos/litro. La principal ventaja de los procedimientos espectrofotométricos (Ver Figura No.2), es que en la mayoría de los casos, no necesitan el aislamiento de la sustancia por técnicas de separación para su cuantificación sino que permiten su medida aún al estaren mezcla con otras sustancias.
Es importante recordar que la absorbancia como tal no es una cantidad medible directamente, ella se obtiene por el cálculo matemático de los datos de la transmitancia (Recuerda usted el viejo truco? A= 2 - Log%T). Siguiendo este concepto, cuando la concentración de un compuesto en solución aumenta: más luz es absorbida por la sustancia, menos es trasmitida y porlo tanto, menos luz llega al detector. Pero para dar mas claridad a este concepto se siguen dos normas fundamentales que fueron claramente definidas por los señores Lambert y Beer.
Ley de Lambert y Beer:
La concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la energía radiante transmitida.
Si laconcentración de un compuesto es constante y la longitud del camino que la luz debe atravesar en la solución se duplica, el efecto sería el mismo que el que se obtiene al duplicar la concentración del analito en la solución, en razón a que habrá el doble de moléculas en el camino que atraviesa el haz de luz. De hecho, la longitud del camino óptico es directamente proporcional a la absorbancia.Limitaciones: (Desviaciones a la ley de Beer)
Se miden concentraciones muy elevadas (perdida de linearidad).
La energía de la radiación incidente no es monocromática.
Existe una pobre diferencia entre blanco y muestras.
Se filtra luz parásita por los dispositivos de detección.
Se utilizan celdas de baja calidad, cuyas paredes no son paralelas (efecto de aberración cromática).
INSTRUMENTAL
Figura No.2 Elementos de un espectrofotómetro de haz simple.
Los equipos utilizados para la cuantificación de sustancias químicas, normalmente tienen los siguientes componentes básicos:
1. Fuente estable de energía radiante
2. Selector de longitud de onda
3. Portacubeta
4. Detector de señal
5. Dispositivo para leer la información enviada por el detector
Existen dos tipos de selector de longitud de...
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