ADN recombinante

Generación de moléculas de ADN recombinante
La estrategia básica en la clonación molecular es insertar un fragmento de ADN de interés en una molécula que es capaz de replicarse de forma independiente en una célula huésped. El resultado es una molécula recombinante o clon molecular, compuesto de las secuencias del ADN insertado y del vector.
Se pueden obtener grandes cantidades del ADNinsertado si se permite replicarse a la molécula recombinante en un huésped apropiado. Por ejemplo, se pueden clonar fragmentos de ADN humano pueden ser clonados en vectores plasmídicos. Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares de ADN que pueden replicarse independientemente sin estar asociados con el ADN cromosómico en bacterias.
Los plásmidos recombinantes que portan insertos de ADN humanopueden ser introducidos en E. coli donde replican junto con las bacterias para dar lugar a millones de copias del ADN plasmídico. El ADN de estos plásmidos puede aislarse obteniéndose grandes cantidades de moléculas recombinantes que contienen un fragmento único de ADN humano. Mientras que un fragmento típico de ADN de una longitud de 1kb representaría menos de una parte de un millón de ADN genómicohumano, representaría aproximadamente una parte en cinco después de ser clonado en un vector plasmídico. Adicionalmente el fragmento puede ser aislado de manera sencilla del resto del ADN del vector utilizando las mismas endonucleasas de restricción usadas para su inserción y realizando una electroforesis en gel, permitiendo el análisis y posterior manipulación de un fragmento puro de ADN humano.Los fragmentos de ADN utilizados para crear moléculas de ADN recombinante son generados por digestión con endonucleasas de restricción. Muchas de estas enzimas cortan sus secuencias de reconocimiento de forma escalonada, generando extremos complementarios o cohesivos de una sola hebra que pueden asociarse entre sí por apareamiento complementario de bases. Los extremos complementarios emparejadospueden conectarse de forma definitiva por medio de una ADN ligasa, una enzima que repara roturas en las hebras de ADN. De esta forma dos fragmentos distintos de ADN acondicionados tras digestión por la misma endonucleasa de restricción pueden ser unidos para crear una molécula de ADN recombinante.
Los fragmentos de ADN que pueden ser clonados no se limitan a aquellos que terminan en sitios decorte de enzimas de restricción. Es posible añadir a los extremos de cualquier fragmento de ADN, permitiendo que prácticamente cualquier fragmento de ADN sea ligado a un vector y aislado como un clon molecular.
Además del ADN, es posible clonar también secuencias de ARN. El primer paso es sintetizar una copia de ADN a partir del ARN por medio de la transcriptasa inversa. El ADN producido se ligaal vector de ADN del modo antes descrito. Dado que los genes eucarióticos están habitualmente interrumpidos por secuencias no codificantes o intrones que se eliminan en el ARNm por corte y empalmado o splicing, la posibilidad de clonar ADNc además del ADN genómico ha sido crítica para el entendimiento de la estructura y función de los genes. Además, la clonación del ADNc permite que el ARNmcorrespondiente a un solo gen sea aislado como un gen molecular.

Vectores para ADN recombinante
Dependiendo del tamaño del ADN que se inserta y del propósito del experimento es posible utilizar distintos vectores de clonación para generar moléculas recombinantes. Los sistemas más básicos para el aislamiento y propagación de ADN clonado se exponen aquí. Otros tipos de vectores desarrollados paraexpresar ADN clonado e introducir moléculas recombinantes en células eucarióticas se discuten en secciones posteriores.
Los plásmidos generalmente se usan para clonar insertos de ADN genómico o ADNc de hasta unos pocos miles de pares bases. Los vectores plasmídicos generalmente consisten en 2 a 4 kb de ADN, incluyendo un origen de replicación la secuencia de ADN que señaliza a la ADN polimerasa de...