Biomoleculas

PRÁCTICA 5

CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES
Y CROMATOGRAFÍA DE CARBOHIDRATOS EN PAPEL

INTRODUCCIÓN
La cromatografía es un método eficaz para la separación de mezclas de carbohidratos, lo cual hace factible su identificación si se aplican en la cromatografía carbohidratos conocidos, a través de la comparación de la migración y directamente por los valores de Rf.

Desde 1906, elbotánico Tswett logró separar los pigmentos de las hojas por percolación de su solución en éter de petróleo a través de una columna de carbonato de calcio pulverizado, donde la materia colorante aparece dividida en zonas diversamente coloreadas; sin embargo, este método no llamó particularmente la atención del mundo científico hasta su nuevo descubrimiento y perfeccionamiento por Kuhn y E. Lederer(1931). A partir de este momento no cesó de extenderse el campo de sus aplicaciones y ha sido precisamente en química biológica, vegetal y animal, donde han logrado sus éxitos más brillantes.

Hay dos tipos de cromatografías, en la cromatografía de papel la celulosa de las fibras de papel está hidratada. A medida que un disolvente que contiene una mezcla de diferentes sustancias asciende porcapilaridad por el papel, mantenido en posición vertical (o desciende en la cromatografía descendente), se producen multitud de distribuciones microscópicas de las diferentes sustancias en estudio entre la fase que fluye y la fase estacionaria acuosa, ligada a las fibras de papel. Al final del proceso las diferentes sustancias han recorrido distancias diferentes desde su origen. Las moléculasanalizadas se caracterizan por su Rf, que es la relación de la distancia recorrida por el soluto entre la distancia del origen al frente del solvente.

El análisis de la composición de carbohidratos de una muestra se complementa siempre con la determinación de la concentración total de carbohidratos de dicha muestra. Uno de los métodos empleados para ello es el de Nelson-Somogy que consiste enhacer reaccionar un azúcar reductor con el ión cúprico en medio alcalino, se forma óxido cuproso de color rojo que precipita y es insoluble (como en el caso de la prueba de Fehling), como no puede valorarse fotométricamente, pero si se trata con el reactivo de arsenomolibdato, se formará una solución con intensidad de color proporcional a la concentración del precipitado cuproso. En este método elfactor limitante es el agente reductor (glucosa) estando los reactivos en exceso, por lo que puede usarse para medir la cantidad de Cu2O que es proporcional a la cantidad de glucosa originalmente presente. La reacción se aplica con buenos resultados a filtrados de sangre y otras soluciones, la sensibilidad es de 25 a 250 g/ml.

OBJETIVO

- Identificar los azúcares que contiene una mezclaproblema de carbohidratos por medio de una cromatografía en papel.
- Obtener la concentración de azúcares reductores de la misma muestra.

MATERIAL REACTIVOS
1 cámara cromatográfica.
1 parrilla eléctrica.
1 mortero con pistilo.
8 tubos capilares.
Papel Whatman del No. 3.
1 Espectrofotómetro.
1 vaso de precipitados 250 ml.
1 vaso de precipitados de 100 ml
1 gradilla.
1 piseta con aguadestilada.
1 pinza para tubos de ensayo.
3 pipetas de 10 ml.
3 pipetas de 1 ml.
4 tubos para microcentrífuga.
1 gradilla para tubos de microcentrífuga.
Micropipetas de volumen variable. Mezcla de N- propanol-acetato de etilo-agua (7:1:2).
Solución de NaOH 0.5 % en etanol.
Solución de NH4OH 2M.
Carbohidratos de referencia: manitol, sacarosa, mio-inositol, dextrosa, sorbitol, fructosa,xilosa
Solución de AgNO3.
Glucosa 100 g/ml.
Reactivo de arsenomolibdato.
Reactivo de cobre estabilizado en medio alcalino.

Material que deberá traer el alumno.
Papel aluminio.
Guantes de látex.
Hilo blanco y aguja.
Muestra de cualquier origen.

MÉTODO
A) Obtención de la muestra.

1. Pese 1.0 g de hojas de cualquier planta verde y macérelas en 30 ml de etanol al 80 %. Si trabaja con...