cromatografia liquida

Cromatografía liquida de alto rendimiento
Los procedimientos cromatograficos son procesos separativos basados en que las sustancias a separar se reparten entre dos fases de forma multiplicativa, es decir repetida. Una de las fases esta inmóvil, es decir, fija (=fase estacionaria) y la otra fase se mueve (=fase móvil). Durante la separación, la fase móvil atraviesa la fase estacionaria. La faseestacionaria es un solido (adsorbente, sorbente) o un liquido. La fase móvil es un gas insoluble o un liquido inmiscible con la fase estacionaria y en una nueva variante un gas supercrítico, es decir , un fluido (la denominada SFC, Supercritical/Fluid Chromatography).
Introducción:
La cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC), ( y también denominada cromatografía liquida de altasolución) es un procedimiento que permite muy buenas separaciones dentro de un gran número de sustancias en un tiempo corto (orden de magnitud : de min hasta 1hora). Mientras que la GC solo permite separar sustancias que se volatilizan a temperaturas elevadas sin degradarse o de las cuales se obtienen derivados volátiles reproducibles, la HPLC ofrece la posibilidad de separar sustancias o grupos desustancias poco volátiles o térmicamente inestables o que solo se transforman con dificultad en sus derivados volátiles. Puesto que la fase móvil, como indica el nombre de HPLC, es un líquido, es condición imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente. Con excepción de las redes de alto peso molecular, esta condición se cumple para todas las sustancias organicas y las inorgánicas ionicas.De forma análoga a la GC, la HPLC permite obtener resultados tanto cuantitativos como cualitativos. Las separaciones se optimizan variando las dimensiones de la columna, la constitución química de la superficie del material de relleno, su tamaño de grano, las características del poro y la composición del eluyente.
Figura 1. Esquema de una separación por HPLC:
E = Deposito de eluyente,
P =Bomba (sistema para la administración de disolvente),
I= inyector (Bucle o para la muestra),
S = columna de separación (eventualmente en un horno termostatizado),
D = detector.
Aparatos y materiales (en general)
Deposito para el eluyente.
Placa filtrante de metal sinterizado (para filtrar el eluyente)
Bomba de alta presión (Eventualmente con indicador de flujo)
Valvula de seguridadManometro y vaporizador de pulsación
Inyector (por lo general sistemas con bucle para la muestra: 1-2.000 µl, frecuentemente de 20 µl)
Detector
Registrador / integrador
Microjeringa (de volumen adecuado al del bucle)
}recipiente para recogida de disolvente
Eventualmente, horno termostatizado para la columna)
Tipos de columna y de partículas
La mayoría de las columnas de HPCL están hechas de aceroinoxidable (cromo-niquel-molibdeno-acero) y menos frecuentemente de vidrio. Con fines analíticos se utilizan por lo general columnas con un diámetro interno (ID) de 2-5 mm. Si se trabaja con microparticulas (3, 5, (7), o 10 µm de diámetro) la longitud de las columnas será de 5, 10, 15 o 25 cm (dependiendo del tipo de problema, la longitud será distinta en función del diámetro de lasmicroparticulas. Como cierre de las columnas se utilizan placas filtrantes de acero, cuya anchura de poro deberá ser menor que el tamaño de grano del relleno de la columna (Por ej., de 2µm para partículas de 5 µm). Para que la separación sea buena, la trayectoria de la difusión en los poros deberá ser corta. Hoy en dia suelen utilizarse microparticulas (frecuentemente de 5 µm de diámetro). Los materiales derelleno de la columna deben ser resistentes a la presión. Se distinguen dos tipos de materiales:
a) Partículas enteramente porosas:
Tienen forma irregular o esférica y diámetros como máximo de 3, 5, (7) o 10 µm, con intervalo de criba mas estrecho.
b) Partículas esféricas de superficie porosa:
Las llamadas porous layer beads (PLB) o , con diámetros de 30-60 µm en las que existe un nucleo...