Espectrofotometría en Hemoglobina

Espectrofotometría en Hemoglobina
INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la
detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su
aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc) y estad o
de agregación (sólido, líquido, gas).
Las moléculas pueden absorber energíaluminosa y almacenarla en forma de energía
interna. La mecánica cuántica nos dice que la luz está compuesta de fotones cada uno de
los cuales tiene una energía:
Efotón = h×v = h×c/λ
En esta práctica estudiaremos el fenómeno absorción de absorción de la radiación
ultravioleta cercano (λ»325 -420nm) de las moléculas orgánicas e inorgánicas.
La región visible, a la que es sensible el ojo hu
mano, selocaliza entre los 380 y 780 nm.

U.V lejano → U.V cercano → Visible
0.6 – 190 nm 190 – 380 nm380 – 780 nm

Cuando una molécula absorbe un fotón en este intervalo espectral, se excita pasando un
electrón de un orbital del estado fundamental a un orbital excitado de energía superior , por
lo tanto, la longitud de onda de los máximos de absorción se puede relacionar con los
enlaces de lasespecies absorbentes.
El espectrofotómetro detecta la cantidad de luz transmitida o absorbida a través de la
solución en la celda y la compara con la que se transmite o absorbe a través de una
solución de referencia denominada “blanco”. La lectura en la escala ya está convertida en
absorbancia. La transmitancia de la mu estra se define como la relación de la radiación
transmitida y la incidente(T= I/ I0). La disminución de la intensidad de la radiación
depende de la concentración del absorbente y de la longitud del camino recorrido por el
haz. Estas relaciones se recogen en la Ley de Lambert-Beer-Bourger:

1

A = -log T
A = log (I / I0) = (ε×b) ×c
ABSORBANCIA = (ε × b) × c
que establece una relación lineal entre la absorbancia y la concentración, donde:
ε= es la constante deproporcionalidad llamada coeficiente de absorción molar,
absortividad molar o coeficiente de extinción (M -1 cm-1). Es la característica de una
sustancia que nos dice cuánta luz absorbe a una longitud de onda determinada.
b=es el paso óptico, anchura de la celda que contiene la muestra (cm).
C= es la concentración de la especie de la cual estamos midiendo la absorbancia (M).
La ecuaciónmencionada es el fundamento de la espectrofotometría. La ley de Lambert Beer-Bourger se cumple para una radiación monocromática que atraviesa una disolución
diluida (≤ 0.01M), cuando la especie absorbente no participa en un equilibrio que dependa
de su concentración (Brunatti).

RESULTADOS
Experimento 1:
TABLA I. ESPECTRO DE ABSORCIÓN Y ABSORBANCIA
Longitud
onda (nm)
370
380
390
400
405410
415
420
430
440
450
460
470
480
490
500

de Absorbancia
0.410
0.548
0.807
1.321
1.537
1.358
0.916
0.552
0.203
0.096
0.063
0.051
0.044
0.046
0.052
0.056
2

510
520
530
540
550
560
570
580
590
600

0.052
0.044
0.035
0.030
0.018
0.011
0.008
0.008
0.001
0.001

Al considerar al espectro de absorción entre 370 y 600 nm en intervalos de 10 nm, lamayor
absorbancia se detectó a 410 nm. Para ubicar un pico único, se redujo el intervalo a 5nm en
este punto, por lo que se leyeron las absorbancias a 405 y 415 nm. Se encontró que la
máxima absorbancia (1.537) se registraba a 405 nm (Ver gráfica 1) .
Experimento 2:
Para leer las absorbancias de esta curva de calibración se consideró 405 nm como la
longitud de onda más adecuada, ya que deacuerdo al experimento 1 registraba A máxima.
Se obtuvo las absorbancias de cada tubo que se presentan en la siguiente tabla:
TABLA II. ABSORBANCIAS DE CADA MUESTRA
TUBO
1
2
3
4
5
6
MP

A
0.029
0.178
0.327
0.497
0.596
1.104
0.180

Tras registrar todas las absorbancias de cada tubo, se procedió a calcular las
concentraciones de cada uno. Para ello se aplicó la siguiente...