Fluorescencia

ESPECTROSCOPÍA DE
FLUORESCENCIA
MOLECULAR
Introducción
Principios teóricos
Instrumentación
Aplicaciones

Introducción: Fenómenos luminiscentes
moleculares
emisión de radiación por
parte de determinadas sustancias que se
encuentran en un
estado electrónico excitado
 Fotoluminiscencia
 Quimioluminiscencia
 Bioluminiscencia
 Termoluminiscencia
 Radioluminiscencia
 Triboluminiscencia

Emisi
ónde
prE
exEmisión
citado Ede
o procedente
•Fluo
s por cedente de
rescende E procedente
radia
nivele
moléculas,
una
Emisión
ción de
cia: Aproducto
UV-V s
b
s
o
r
is
c
reacción
química
ión una
moléculas,
producto
de
•Fosfo
1
y
-2
0
e
m
-10 -9 s
rescen
e isión en
t
reacción
en
sistema
n
cia:un
e
d
Apbrsoocre
Emeisnibiológico
ciónpyor te
>
E
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Em molélcaus exc temacned
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s
l
a
as
u
ad
s
éc culaesxexcit

olé cióncitadas
mol m
medfirainctde
alta
partículas e cal
orenergía

Fotoluminiscencia

Se divide en dos categorías:
fluorescencia y fosforescencia dependiendo
de la naturaleza del estado excitado.
Emisión
luminiscente

ESPÍN DEL ELECTRÓN:
SINGLETES Y TRIPLETES
Moléculas en estado
fundamental
OM con 2 e- espinesopuestos

e- en nivel
energético
superior con
espines opuestos
SINGLETE

h

SINGLETE

e- en nivel
energético
superior con
espines paralelos
TRIPLETE

Fluorescencia y fosforescencia
Transición PERMITIDA

FLUORESCENCIA

Estado excitado SINGLETE
Rápido retorno al
estado fundamental

Transición PROHIBIDA

Tiempo de vida 10 ns

FOSFORESCENCIA

Estado excitado TRIPLETE
Velocidad de
emisión lentaTiempo de vida ms a s

Diagrama de Jablonski
Diagrama típico de los niveles energéticos para una molécula
luminiscente

Excitación

Tiempo requerido
para el proceso de
absorción del
fotón: 10-15 – 10-14 s

Molécula  h  Molécula 

Relajación vibracional y Conversión
interna y externa
Conversión interna:
Relajación vibracional:
Pérdida de E vibracional
excesiva en forma de choques
entre laespecie excitada y
otras (ΔT mínimo)
Muy rápido (10-10 – 10-13 s)
Ocurre siempre.
Todos los procesos pueden
considerarse originados desde
el nivel vibracional más bajo
de un estado electrónico
excitado
La emisión fluorescente se
produce a >  excitación

Nivel vibracional inferior de un estado electrónico excitado
Nivel vibracional superior de un estado electrónico de E inferior
(Sin emisión deradiación)

Conversión interna

Espectros de excitación y
emisión de quinina

Fluorescencia
Nivel vibracional
inferior SINGLETE  Estado fundamental  h
excitado

Proceso inverso a la absorción

Relación inversa entre  y
tiempo de vida del estado
excitado

= 103 -105

tiempo de vida de S* = 10-7 -10-9 s

 < 103

tiempo de vida de S* = 10-5 -10-4 s

Cruce entre sistemas
Nivel vibracional inferiorde
singlete excitado

Nivel vibracional superior
de un triplete
(Sin emisión de radiación)
(Seguido de relajación
vibracional)

Cruce entre sistemas
Cambio en el spin del eVelocidad < C.I.

Espectros de excitación y emisión

Espectros de excitación y emisión
Espectro de
excitación

Espectro de emisión

Variación de IF al variar la
exc. a una em = cte
Eficacia de las diferentes exc. paraproducir fluorescencia

Variación de IF al variar la em a
una exc = cte
Intensidad de la radiación
emitida a diferentes 

Factores que afectan a la fluorescencia
 Del compuesto:
Rendimiento cuántico
Estructura molecular

 Del entorno químico:
Disolvente
Temperatura
pH
Presencia de O2

Rendimiento cuántico (0 < F < 1)
No. fotones emitidos como fluorescencia
F 
No. fotones absorbidos

Función dela velocidad del proceso de desactivación por
emisión/velocidad de otros procesos de desactivación

KF
F 
K F  K CI  K CS  ...

Estructura molecular

Estructura molecular: Transiciones
electrónicas
* anti-enlazante

Energía
n
n

*

 *

* antienlazante

*


 *
 *
*
n no-enlazante
-enlazante
-enlazante

➝ * mayor rendimiento cuántico >...