Genetica molecular

INGENIERÍA GENÉTICA

CUADERNO DE PRÁCTICAS
EQUIPO 3.1, TURNO 1
SUSANA BELLO CONDE LUISA BUSTAMANTE JARAMILLO RICARDO GONZÁLEZ TARANCÓN

PREGUNTA 1: Comparar el método de mutagénesis por PCR con el utilizado. ¿Cuáles son las principales diferencias entre los dos métodos? El método convencional de mutagénesis por PCR se basa en la incorporación de la mutación deseada mediante el empleo decuatro oligonucleótidos (cebadores): dos terminales y los otros dos internos; estos últimos son complementarios e incluyen la mutación. Por el contrario, en el método Quick Change, se emplean sólo dos oligonucleótidos complementarios y antiparalelos portadores de una mutación concreta en posición central. En el método convencional de mutagénesis por PCR es necesario realizar tres PCRs consecutivashasta obtener la secuencia portadora de la mutación. En las dos primeras reacciones se introduce la mutación, generando productos que tras posteriores tratamientos hibridan, gracias a la complementariedad de los cebadores internos y a la posterior elongación de las hebras por la polimerasa; son éstos el objeto para la amplificación mediante una tercera PCR con la utilización de nuevo de loscebadores extremos. Como resultado final obtenemos la secuencia portadora de la mutación deseada. El método Quick Change, cuenta con la ventaja, de que con una sola PCR se introduce la mutación dentro del DNA plasmídico que se desea mutar. Cabe destacar otra diferencia fundamental, y es que en la PCR convencional se emplea la polimerasa Taq, que no tiene capacidad correctora de errores (por ello puedeintroducir más mutaciones que la deseada), mientras que en el método Quick Change se emplean polimerasas con alta capacidad procesativa y actividad correctora de errores, como la polimerasa Phusion o la Pfu turbo. Cualquiera de ellas presenta una tasa de mutación muy baja y por ello el rendimiento del proceso es mayor que en la PCR convencional. Por último, en el método Quick Change es necesarioeliminar el plásmido original, para ello empleamos la enzima de restricción DpnI, siendo innecesario este paso en el proceso de PCR convencional.

PREGUNTA 2: ¿Qué interés puede tener la modificación mediante mutagénesis de una proteína? La modificación de una proteína mediante mutagénesis tiene importancia desde el punto de vista estructura-función, ya que mediante estos estudios podríamoscomprobar la implicación de la misma en un determinado proceso; ya que si sospechamos que una determinada proteína realiza una determinada función, podemos alterar la proteína, y así, tras su estudio, poder concluir su ausencia o implicación en el proceso. Como ejemplo de esto, podemos pensar en la modificación de ciertos aminoácidos presentes en lacZα (Aspartato15-Arginina13) que se sabe que estánimplicados en la formación del homotetrámero funcional de la β-galactosidasa. Podemos diseñar un experimento, mediante el cual se consiguiese mutar alguno de estos aminoácidos y la perdida de función que conlleva, haría que aceptásemos el supuesto inicial. También es interesante poder regular la actividad de una proteína mediante mutaciones en el centro activo, centro alostérico o bien regular suactividad a través de

sus niveles de expresión (creando un promotor más fuerte o más débil). Estas aplicaciones son especialmente importantes en terapia génica humana, para el tratamiento de algunas enfermedades. Otra utilidad que se nos ocurre es la mejora de cepas en la elaboración de un producto de interés, haciéndola hiperproductora o suprimiendo alguna ruta que la lleve a dar lugar a unproducto no deseado; podemos conseguir este propósito, alterando la actividad de proteínas reguladoras o represoras de determinados promotores. Todo esto es muy interesante desde el punto de vista de producción industrial.

PREGUNTA 3: Explica las diferentes estrategias que se pueden utilizar para inactivar la proteína (MBP) y razona la respuesta en función del tipo de mutación. Para inactivar una...