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Síntesis de productos comerciales por microorganismos recombinantes
Hasta la fecha, la investigación en biotecnología molecular se ha centrado en gran medida en la producción de una gama de diferentes proteínas, incluyendo enzimas que se utilizan comercialmente. Sin embargo, las técnicas de ADN recombinante también pueden usarse para mejorar la producción de compuestos de bajo peso molecular,tales como vitaminas, aminoácidos, colorantes, precursores de biopolímeros, y antibióticos. En estos casos, el microorganismo huésped está diseñado para ser una fábrica para la producción de metabolitos útiles.
Las endonucleasas de restricción.
La tecnología de ADN recombinante no sería posible sin un suministro de diferentes endonucleasas de restricción. Actualmente, más de 300 endonucleasas derestricción diferentes están disponibles comercialmente, con ventas mundiales en 2007 en el rango de $ 350 millones. Estas enzimas se producen de forma natural en muchos microorganismos diferentes, incluyendo especies que son aeróbicas, anaeróbicas, fotosintéticas, diazotróficas, mesófilos, termófilos y psicrofílicas, ya sea de lento o rápido crecimiento. Para cada uno de estos organismos, unafermentación detallada por protocolo especificando la temperatura, pH, composición del medio, y la tensión de oxígeno tiene que ser desarrollado y optimizado para lograr el máximo rendimiento de la enzima de restricción de destino. Para evitar tener que mantener un gran número de diferentes microorganismos, las acciones de una muy amplia gama de microbios componentes del medio de crecimiento,diseño varios diferentes tipos de fermentadores, y pasar una cantidad excesiva de tiempo el desarrollo de condiciones de crecimiento óptimas para un gran número de organismos diferentes (uno de los principales proveedores de enzimas de restricción listas de 265 enzimas diferentes en su catálogo), los investigadores a menudo clonan genes de endonucleasas de restricción en Escherichia coli. El usoexclusivo de E. coli permite estandarizar las condiciones de producción para todos los endonucleasas de restricción. Además, las células de E. coli crecen rápidamente a altas densidades de células y pueden ser diseñados para sobreexpresar significativamente cada enzima de restricción.
Aunque la tecnología para el aislamiento y la expresión de genes extraños en E. coli y otros organismos de acogida estábien establecido, hay que recordar que el organismo huésped es una entidad viva que puede ser afectada dramáticamente por la producción o la presencia de una proteína heteróloga. Por ejemplo, la sobreexpresión de una proteína heteróloga puede drenar el organismo huésped de los recursos metabólicos importantes y, como consecuencia, afectar adversamente su crecimiento. Además, la presencia de unaproteína heteróloga puede ser letal para el huésped. Por ejemplo, las endonucleasas de restricción digieren el ADN en sitios que están presentes en todas las moléculas de ADN. Como resultado, un organismo que expresa un gen de endonucleasa de restricción clonado es probable que tenga su propio ADN degradado a menos que un mecanismo de protección está presente.
Los microorganismos que formanendonucleasas de restricción han desarrollado un sistema de auto-protección. La metilación de una o más de las bases del ADN dentro de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción impide homólogamente cortar el ADN en este sitio (Fig. 13.1A). Los microorganismos Gram-negativos tienen un modo de protección adicional que implica la localización de la endonucleasa de restricción dentrodel espacio periplásmico y la metilación (modificación) de la enzima en el citoplasma de células (Fig. 13.1B). Esta compartimentación separa físicamente la endonucleasa de restricción del ADN garantizando al mismo tiempo que la enzima de modificación tiene acceso listo para el ADN cromosómico. Además de proteger a la célula de los efectos tóxicos de la enzima de restricción, esta segregación...