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TEMA 18 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO



1. Introducción

La MEB nació en 1958por Manfred Von Arden cuando basándose en estudios experimentales construyó un prototipo de microscopia de esta índole. Sin embargo, no alcanzó un completo desarrollo hasta los años 60.
Las dificultadas planteadas en el procesamiento de los especimenes biológicos hicieron q las investigaciones realizadassobre este material no avanzaran tanto como los estudios sobre materiales inorgánicos.
Hoy día, subsanados casi todos los problemas relacionados con el proceso de las muestras, la MEB constituye un método sumamente útil para el estudio de la morfoestructura superficial de las muestras biológicas y, en consecuencia, un medio complementario de análisis q suministra importante información sobre laestructura de células y tejidos.
En comparación con la ME convencional, la MEB presenta dos ventajas:
Permite observar áreas mucho mayores sobre la superficie de los objetos.
Puede proporcionar más información sobre la estructura y composición del objeto debido a la gran cantidad de interacciones q realizan los electrones del haz de observación entre sí y con el propio objeto de estudio.

2.Principios básicos de la MEB

En la MEB un haz de electrones emitidos por un filamento de tungsteno q actúa como cátodo es dirigido hacia la muestra a través de una columna incluida en el microscopio. Este haz se desplaza sobre la muestra realizando un barrido de su superficie q es proyectado sincrónica y simultáneamente sobre la pantalla de observación.
Dependiendo de la señal detectada lainformación q proporciona el instrumento puede hacer referencia a:
Al poder de emisión de electrones secundarios arrancados de la muestra por el haz primario.
A la capacidad de incluir cambios eléctricos sobre un objeto q actúa como semiconductor (efecto inducido).
A la emisión de luminiscencia debido a la liberación de fotones por parte del objeto sometido a la irradiación electrónica.
A ladetección de los electrones residuales q atraviesan la superficie.

Cuando la información hace referencia sobre todo a electrones absorbidos y al efecto de fotoluminiscencia se obtiene una imagen 3D del objeto de estudio.
Los componentes básicos del MEB son:
Cañón de electrones: emiten los electrones q chocan contra el espécimen creando una imagen aumentada.
Lentes magnéticas: crean campos qdirigen y enfocan el haz de electrones.
Sistema de vacío: es muy importante en el ME debido a q los electrones pueden ser desviados por el aire. Se debe hacer un vacío total (10-5Pa).
Placa fotográfica o pantalla fluorescente: se coloca detrás del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada.
Sistema de registro: muestra la imagen q producen los electrones. Suele ser una computadora.
3.Procesamiento de las muestras

Debido a la gran variedad de los materiales susceptibles de ser observados con MEB los criterios metodológicos para su preparación son a sí mismo muy numerosos. No obstante, es posible esbozar una pauta general aplicable a muestras biológicas.
Lavado minucioso con suero salino de la superficie objeto de estudio.
Fijación del material: esta fase persigue dar unaadecuada estabilidad a la muestra. Se usan fijadores químicos del tipo de aldehídos. El más usado es el glutaraldehido al 2.5%. La presión osmótica del fijador debe regularse usando un tampón tipo fosfato. Tb se puede usar el tampón cacodilato. El tiempo q debe permanecer la muestra en el fijador es variable y depende de la experiencia de cada laboratorio al igual q el tipo de solución amortiguadoraempleada. El tiempo suele oscilar entre 2-24h según el tamaño considerándose como tiempo medio 6h. Una vez fijadas las muestras se lavan en solución amortiguadora, generalmente tres cambios de 10-15 min cada uno.
Tratamiento postfijación: esta fase es importante ya q previene la deformación del secado al aire cuando no se dispone del procedimiento del punto crítico, aumenta la conductividad...