Pcr para enfermedades infecciosas

CAPÍTULO 1.1.3

VALIDACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA UTILIZADOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

RESUMEN El diagnóstico de las enfermedades infecciosas se realiza mediante la detección directa o indirecta de los agentes infecciosos. Mediante los métodos directos, se detectan los agentes y/o sus componentes, tales como los ácidosnucleicos, las proteínas estructurales y no estructurales, los enzimas, etc. Mediante los métodos indirectos, se detectan los anticuerpos inducidos por las infecciones. Los métodos más frecuentes de detección directa son el aislamiento del virus, el cultivo de bacterias (las dos pruebas de referencia), la microscopía electrónica, la inmunofluorescencia, la inmunohistoquímica, elenzimoinmunoensayo de detección de antígeno, la hibridación del ácido nucleico (NAH), y la amplificación del ácido nucleico, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como las técnicas NAH y PCR se centran en las moléculas, también se las conoce como técnicas o métodos de diagnóstico molecular. Los métodos indirectos más comúnmente utilizados para la detección de los agentes infecciosos son laneutralización vírica, la detección de anticuerpos mediante el ELISA y las pruebas de inhibición de la hemoaglutinación. Por lo general, los laboratorios aplican de forma simultánea lo métodos directos e indirectos, a fin de asegurar la fiabilidad del diagnóstico. Se han propuesto directrices de la OIE para la aplicación de los métodos de detección indirecta, i.e. para la detección de anticuerpos medianteELISA (véase el capítulo 1.1.2). El propósito del presente capítulo es extender la aplicación de las reglas a un método directo de detección del agente infeccioso; más concretamente, se trata de adaptar las directrices o principios de validación a los ensayos PCR. Las experiencias de la última década indican que la técnica PCR terminará por imponerse a muchos de los clásicos métodos directos dedetección del agente infeccioso. Es un hecho cierto que en muchos laboratorios de diagnóstico las técnicas PCR están reemplazando al aislamiento vírico o al cultivo de bacterias en los casos de detección de agentes que resultan difíciles o imposibles de cultivar. Son varias las razones que explican esa tendencia; una de ellas es que el aislamiento vírico requiere: i) la presencia de virus replicantes;ii) cultivos celulares y medios de mantenimiento que resultan caros; iii): un tiempo de no menos de varias semanas para completar el diagnóstico; y iv) conocimiento de experto innecesario en muchos laboratorios. Aunque inicialmente la utilización de los ensayos PCR era cara y compleja, en la actualidad son relativamente baratos, seguros y fáciles de utilizar en los laboratorios de diagnóstico(2,7).

A. MÉTODOS DE PCR UTILIZADOS EN DIAGNÓSTICOS MOLECULARES RUTINARIOS 1. PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA DE LA PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) implica una reacción de amplificación durante el ensayo. El término “reacción en cadena” se refiere a los varios ciclos de copiado de un fragmento específico de ADN a partir de un ácido nucleico diana, en este caso, del genoma del agenteinfeccioso. La región amplificada se caracteriza por dos (o más) oligonucleótidos cortos y dos cebadores que son complementarios con las regiones de ADN que flanquean la secuencia diana. Utilizando una ADN-

Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006

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Chapter 1.1.3. - Validación y control de calidad de los PCR utilizado para el diagnóstico de enfermedades infecciosaspolimerasa termoestable, que no resulte desnaturalizada durante el ciclo de calentamiento, es posible copiar la secuencia de ADN entre los dos cebadores. Repitiendo de 20 a 40 veces el régimen de ciclos de calentamiento, se obtendrá una cantidad de ADN diana copiado que será suficiente para operaciones ulteriores, tales como la detección, el clonado y la secuenciación. La sensibilidad de...