Practica 4

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES

INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA

PRÁCTICA 4 Estabilidad de una enzima inmovilizada y libre, determinación de Vmax y Km.
OBJETIVOS 1. Establecer el efecto de la inmovilización en la estabilidad de una enzima. 2. Determinar el efecto de la inmovilización en la constante deMichaelisMenten (Km) y la velocidad máxima (Vmax.) y su relación con la estabilidad. INTRODUCCIÓN La inmovilización puede altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos,inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional, estérico y del microentorno. Efectos en la estabilidad Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después de su inmovilización, que sedebe principalmente a las siguientes razones: 1. Una estabilización conformacional de la enzima debido a la existencia de uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la enzima adquiere mayor rigidez y se hace más resistente a la desactivación térmica o química. Este tipo de estabilización se obtiene únicamente en aquellos métodos en los que intervienen enlaces de tipocovalente, como el reticulado o la unión a soportes activados. La inmovilización covalente multipuntual se puede combinar con la adición de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura de la enzima. 2. Una protección frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unión de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteolítica, y evita su autolisis. 3. Se evita la agregaciónintermolecular al mantener las moléculas de enzima retenidas en una determinada región del espacio. 4. Existe una alteración del microentorno del enzima debida a la interacción de la enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxígeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sitúa en la superficie de un soporte cargado, la fuerza iónica efectiva en el microentorno de la enzimaserá muy alta y, como consecuencia, la concentración de oxígeno disuelto será mucho menor en esa 1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES

INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA zona que en el medio de reacción. En otros casos el soporte tiene un efecto tampón o buffer de tal manera que mantiene el pH óptimo de la enzima ensu microentorno, aunque en la disolución se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgánicos, la “hidrofilia” del soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto mayor es la hidrofilia del soporte, más agua adsorbe y la enzima poseerá la cantidad necesaria deagua en su microentorno para mantener su conformación activa. Efectos en la actividad enzimática Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimática puede ser debido a que: 1. La unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al sitio activo está impedido, 2. Los grupos reactivosdel soporte reaccionan con algún aminoácido que forme parte del sitio activo o que sea esencial para la actividad catalítica de la enzima, 3. La inmovilización puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva, las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalización de la enzima. Si la pérdida de actividad no es total después de la inmovilización, los cambios...