Presentation Helicobacter Pylori Biotecnologia PCR-RFLP
Páginas: 6 (1330 palabras)
Publicado: 9 de diciembre de 2015
Resistencia a metronidazol y
claritromicina en aislamientos de
Helicobacter pylori de pacientes
dispépticos en Colombia
Adalucy Álvarez1a, José Ignacio Moncayo1b,
Jorge Javier Santacruz1b, Luisa Fernanda
Corredor1c, Elizabeth Reinosa1d, José William
Martínez2, Leonardo Beltrán3e.
MERYSA RIVERA CÓRDOVA
Introducción- H.pylori
Helicobacter pylori es una bacteria que infecta el epiteliogastrico, su
capacidad de infección es amplia, se dice que afecta al 50 % de la
población mundial y la mayoría de las personas infectadas no
presentará síntomas.
Esta bacteria vive exclusivamente en el estómago, siendo el único
organismo conocido que puede subsistir en un ambiente tan
extremadamente ácido.
Los síntomas que puede provocar varían entre gastritis, ulceras
gástricas hastacarcinoma gástrico.
Su estructura le permite anclarse en la mucosa gastrica.
Diversos estudios han demostrado que la resistencia antimicrobiana
perjudica significativamente la eficacia del tratamiento de H.pylori.
Introducción- Objetivos
El presente estudio se realizó para detectar:
La resistencia a los antimicrobianos; metronidazol, claritromicina,
amoxicilina y tetraciclina enaislamientos de H. pylori,
La distribución de la concentración inhibitoria mínima (CIM) en
las cepas de H. pylori con estos antimicrobianos.
Las dos mutaciones más frecuentes involucradas en la
resistencia a claritromicina.
Metodología
Se obtuvieron 88 cepas de H.pylori por medio de endoscopia en pacientes
con síntomas dispepticos en Colombia.
Las cepas de H.pylori fueron identificadasusando, morfologia de la colonia,
coloracion de Gram y pruebas bioquimicas como oxidasa, catalasa, ureasa y
PCR.
Las 88 cepas fueron aisladas y almacenados en caldo tripticasa soya con
glicerol al 20% a -80°C,y en amortiguador TE a -20°C ;para la extracción de
ADN.
Metodología Etest
1.
La detección de resistencia a antibioticos en las cepas fueron de dos formas:
Método fenotípico, utilizandoEtest para la detección de resistencia a
metronidazol, claritomicina, amoxicilina y tetraciclina.
.
En este, cada una de las cepas de H.pylori se cultivaron durante dos dias en TSAsangre, luego fueron suspendidos en caldo de brucellla, hasta lograr una turbidez
de McFarland 3.
.
Fueron inoculadas en cinco placas de agar Mueller Hinton con sangre.
.
En cada placa, una tirilla delantimicrobiano, y la quinta placa fue el control de
aislamiento.
.
Las placas se incubaron durante 3 dias a 37°C en una atmosfera microaerofilica.
Resultados- Etest
Metodología PCR
2. Metodo genotípico por PCR-RFLP: Para la detección de resistencia a
claritomicina.
La resistencia a claritromicina se fundamenta en mutaciones puntuales situadas
en el ARN ribosomal 23S.
La mayoría de losaislamientos resistentes contienen la mutación A2142G
(11.7%) o A2143G (69.8%).
Ⓡ
Se extrajo el ADN con el kit Wizard (Promega)
Se realizaron PCRs de las 88 cepas con la pareja de iniciadores HPY-S y HPY-A,
para amplificar el fragmento de 267pb del ARN ribosomal 23S.
Metolodología PCR
La amplificación se efectuo con un volumen final de 50µl; con
buffer 1X, MgCl2 , dNTPs, dos iniciadores,Polimerasa Taq y ADN
bacteriano.
Se colocaron en el termociclador Perkin Elmer 9,700; en 35 ciclos
de 95°C por 45s, 60°C por 30s y 72°C por un minuto.
Como controles positivos se utilizaron dos cepas con
mutaciones A2142G y A2143G; como control negativo agua
destilada esteril.
PCR- Corrida Gel Agarosa
Los 50µl del producto de PCR, tanto las muestras como los controles
fueroncorridos en gel de agarosa al 3%, teñida con bromuro de etidio
(0.01mg), buffer TAE 1X a 100voltios, durante 50min.
Las bandas de 267pb fueron cortadas y purificadas con el kit
comercial Promega, siguiendo las instrucciones del fabricante.
PCR-RFLP
La reacción RFLP fue llevada a cabo con las enzimas
de restricción BbsI y BsaI.
Utilizando 5µl del producto de PCR purificado, en un
volumen...
claritromicina en aislamientos de
Helicobacter pylori de pacientes
dispépticos en Colombia
Adalucy Álvarez1a, José Ignacio Moncayo1b,
Jorge Javier Santacruz1b, Luisa Fernanda
Corredor1c, Elizabeth Reinosa1d, José William
Martínez2, Leonardo Beltrán3e.
MERYSA RIVERA CÓRDOVA
Introducción- H.pylori
Helicobacter pylori es una bacteria que infecta el epiteliogastrico, su
capacidad de infección es amplia, se dice que afecta al 50 % de la
población mundial y la mayoría de las personas infectadas no
presentará síntomas.
Esta bacteria vive exclusivamente en el estómago, siendo el único
organismo conocido que puede subsistir en un ambiente tan
extremadamente ácido.
Los síntomas que puede provocar varían entre gastritis, ulceras
gástricas hastacarcinoma gástrico.
Su estructura le permite anclarse en la mucosa gastrica.
Diversos estudios han demostrado que la resistencia antimicrobiana
perjudica significativamente la eficacia del tratamiento de H.pylori.
Introducción- Objetivos
El presente estudio se realizó para detectar:
La resistencia a los antimicrobianos; metronidazol, claritromicina,
amoxicilina y tetraciclina enaislamientos de H. pylori,
La distribución de la concentración inhibitoria mínima (CIM) en
las cepas de H. pylori con estos antimicrobianos.
Las dos mutaciones más frecuentes involucradas en la
resistencia a claritromicina.
Metodología
Se obtuvieron 88 cepas de H.pylori por medio de endoscopia en pacientes
con síntomas dispepticos en Colombia.
Las cepas de H.pylori fueron identificadasusando, morfologia de la colonia,
coloracion de Gram y pruebas bioquimicas como oxidasa, catalasa, ureasa y
PCR.
Las 88 cepas fueron aisladas y almacenados en caldo tripticasa soya con
glicerol al 20% a -80°C,y en amortiguador TE a -20°C ;para la extracción de
ADN.
Metodología Etest
1.
La detección de resistencia a antibioticos en las cepas fueron de dos formas:
Método fenotípico, utilizandoEtest para la detección de resistencia a
metronidazol, claritomicina, amoxicilina y tetraciclina.
.
En este, cada una de las cepas de H.pylori se cultivaron durante dos dias en TSAsangre, luego fueron suspendidos en caldo de brucellla, hasta lograr una turbidez
de McFarland 3.
.
Fueron inoculadas en cinco placas de agar Mueller Hinton con sangre.
.
En cada placa, una tirilla delantimicrobiano, y la quinta placa fue el control de
aislamiento.
.
Las placas se incubaron durante 3 dias a 37°C en una atmosfera microaerofilica.
Resultados- Etest
Metodología PCR
2. Metodo genotípico por PCR-RFLP: Para la detección de resistencia a
claritomicina.
La resistencia a claritromicina se fundamenta en mutaciones puntuales situadas
en el ARN ribosomal 23S.
La mayoría de losaislamientos resistentes contienen la mutación A2142G
(11.7%) o A2143G (69.8%).
Ⓡ
Se extrajo el ADN con el kit Wizard (Promega)
Se realizaron PCRs de las 88 cepas con la pareja de iniciadores HPY-S y HPY-A,
para amplificar el fragmento de 267pb del ARN ribosomal 23S.
Metolodología PCR
La amplificación se efectuo con un volumen final de 50µl; con
buffer 1X, MgCl2 , dNTPs, dos iniciadores,Polimerasa Taq y ADN
bacteriano.
Se colocaron en el termociclador Perkin Elmer 9,700; en 35 ciclos
de 95°C por 45s, 60°C por 30s y 72°C por un minuto.
Como controles positivos se utilizaron dos cepas con
mutaciones A2142G y A2143G; como control negativo agua
destilada esteril.
PCR- Corrida Gel Agarosa
Los 50µl del producto de PCR, tanto las muestras como los controles
fueroncorridos en gel de agarosa al 3%, teñida con bromuro de etidio
(0.01mg), buffer TAE 1X a 100voltios, durante 50min.
Las bandas de 267pb fueron cortadas y purificadas con el kit
comercial Promega, siguiendo las instrucciones del fabricante.
PCR-RFLP
La reacción RFLP fue llevada a cabo con las enzimas
de restricción BbsI y BsaI.
Utilizando 5µl del producto de PCR purificado, en un
volumen...
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