Proteinas

Métodos de precipitación para limpieza de proteínas
1. Precipitación con sulfato de amonio (salting out). Procedimiento general: La muestra de proteína soluble debe de tener una concentraciónaproximada de 1 mg/ml en un buffer que contenga como máximo 50 mM de EDTA. Lentamente agregar la solución de sulfato de amonio hasta obtener el porcentaje de saturación deseado, agitar de 10 a 30 min.Centrifugar y desechar sobrenadante. Limitaciones: Muchas proteínas permanecen solubles a altas concentraciones de sales, por lo que no se recomienda este método cuando se requiere que el total de lasproteínas este representado. Esté método puede ser empleado para prefraccionamiento o enriquecimiento de alguna fracción de interés. Las cantidades residuales de sulfato de amonio pueden interferir con elisoelectroenfoque y tiene que ser removido. Muchos contaminantes potenciales (ej. Ácidos nucléicos) permanecerán en solución. 2. Precipitación con TCA (ácido tricloroacético). Procedimiento general:Añadir el TCA necesario al extracto total de proteínas para obtener una concentración final de 10-20 % de TCA. Dejar precipitar en hielo for 30 min. Centrifugar y lavar la pastilla de proteínas conacetona o etanol preenfriado a -20 C para retirar el TCA residual. Limitaciones: Las proteínas precipitadas con TCA se pueden volver difíciles de resuspender o pueden no resuspenderse completamente. Losresiduos de TCA deben ser removidos con lavados exhaustivos con acetona o etanol. Una exposición prolongad a esta muy bajo pH puede causar cierta degradación de proteínas o modificarlas. 3.Precipitación con acetona: Procedimiento general: Añadir al menos 3 volúmenes de acetona preenfriada a -20°C al extracto. Dejar precipitar a -20°C al menos 2 h. Recuperar las proteínas precipitadas porcentrifugación. Limitaciones: Muchos compuestos que son solubles en solventes orgánicos (ej. Detergentes, lípidos, etc.) pueden permanecer en solución.
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