Revision de métodos espectrofotometricos y elaboración de curva estándar de proteína.

Equipo No. 4
REVISION DE MÉTODOS ESPECTROFOTOMETRICOS Y ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNA.

Objetivos: Medir la concentración de una proteína haciendo uso del método espectrofotométrico, conocer el manejo de micropipetas y espectrofotómetros y construir curvas de calibración para determinar la concentración de proteínas tomando en cuenta la sensibilidad del método.

Hipótesis: Pormedio de un método espectrofotométrico y uno colorimétrico construiremos curvas de calibración para determinar la concentración de una proteína.

Introducción:

Un espectrofotómetro es un instrumento usado para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones, es utilizado para la cuantificación desustancias y microorganismos, tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones: dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra e indicar indirectamente que cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra.

Unagrafica de absorbancia de una especie en disolución, a una longitud de onda dada, como una función de su concentración molar, se llama curva de calibración o curva estándar. Es una línea recta y para la cuantificación de la especie se debe realizar a la longitud de onda máxima.

Métodos para la determinación de proteínas:

Biuret-Alkaline copper reagent: Compuestos con dos o más enlacespéptidos reaccionan con iones cúpricos (Cu2+) en una sln. alcalina donde Cu2+ forma complejo con cuatro átomos de N (dos N de cada una de dos cadenas peptídicas). La sln. cambia a un color violeta rojizo

Lowry-Folin-Ciocalteau Reagent: El reactivo F-C contiene fosfomolibdato y fosfotungstato con constituyentes metálicos oxidados (valencia +6). Estos oxidan residuos de aminoácidos susceptibles enla proteína como el fenólico de tirosina, el indol de triptófano y el sulfhidrilo de cisteína. El resultado es una sal reducida tipo molibdeno, de color azul. La mayoría de las proteínas contienen poco Trp o Cys por lo que el color depende mayormente de la cantidad de Tyr presente en la proteína. La adición de Cu2+ intensifica el color azul 10X
Absorción de luz ultravioleta: Se puede realizara 280 nm (banda de aa aromáticos) o a 205 nm (banda de enlace péptido)

A 280 nm la absorbancia dependerá de la cantidad de Tyr o Trp presente en la proteína: si no tiene estos residuos, el coeficiente de extinción será de E280=0.0
Lisosima, que tiene muchos Tyr y Trp, E280=2.65.
Si se conoce la corrección en la absorción (A280/A260) se puede calcular la concentración de proteínas:[prot] (mg/ml) = A280-A260
A 205 nm se ve menos el efecto de los residuos, pero siempre hay que corregir para el contenido de Trp y Tyr, y la absorción de las hélices alfa y hojas beta
Ensayo de Bradford : El tinte azul de Coomasie 250 tiene absorción máxima a 465 nm. Al unirse a proteína absorbe a 595nm
Bis-cinchoninic Acid Reagent (BCA): Basado en la rx de Folin-Ciocalteau.:
Proteína + Cu2+alcalino Biuret complex
(Cu2+Cu1+) Cu1+ + ácido
bis-cinconínico complejo que absorbe a 562 nm
Cuantificación de proteínas por un método colorimétrico: cuando a un péptido o proteína en disolución básica se le hace reaccionar con cubre se forma un compuesto colorido por coordinación entre los nitrógenos del péptido con el ion metálico.en el método de Lowry el reactivo deFolin-Ciocaulteu se añade para incrementar la cantidad de color desarrollado. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/fosfotungstato, reacción que produce una coloración azul que se lee a 750 nm. La reducción del reactivo de Folin-Ciocaulteu ocurre solamente con los residuos de tirosina y triptófano de la proteína....