Separcion proteinas

Seminario de Purificación de Proteínas

Material de Partida
-Proteína recombinante
-soluble (extracelular, periplasmatica, etc) -cuerpos inclusión (antes o luego de replegado)

-Proteína extractiva
-tejido -células -cultivo

Grado de pureza requerido
• Muy alto ( >99%):
– Uso terapéutico

• Alto (95-99 %):
– Estudios estructurales (cristalografía de rayos X, determinación decaracterísticas fisicoquímicas).

• Moderado (< 95%):
– Pegado de Ac a matriz de inmunoafinidad. – Marcación del Ac para su uso en inmunoanálisis, inmunohistoquímica.

Métodos de clarificación
• Centrifugación-Ultrafiltración:
– Para eliminar agregados insolubles, restos celulares, lipoproteínas y otros materiales lipídicos. (ej.15 min a 10000g, en frío).

• Filtración (0.22-0.40mµ):
–Remueve material micro particulado. Es necesario antes de cualquier paso cromatográfico en FPLC para preservar la columna de cromatografía (especialmente las preempaquetadas).

Enriquecimiento
• Objetivo: aumentar la cc relativa de la proteína de interés / eliminación parcial de contaminantes. • Diálisis • Precipitación:
– Salina (salting-out): la sal extrae agua de solvatación de la proteína –Alcohólica (bajo constante dieléctrica entonces baja la capacidad de solvatación del solvente). – Isoeléctrica ( pH = pI ) – Crioprecipitación (crioglobulinas)

Métodos cromatográficos
• Métodos adsortivos:
– Afinidad, pseudoafinidad, interacción hidrofóbica, interacambiadores iónicos, etc – Concentran la muestra – Se emplean en los primeros pasos de purificación

• Métodos no adsortivos:– Exclusión molecular – Diluyen la muestra – Generalmente se emplean al final

Cromatografía de intercambio iónico
• Principio: se basa en la adsorción reversible que
existe entre una molécula con una carga determinada y un grupo de carga opuesta inmovilizado en la matriz.

• Grupos cargados unidos a la matriz:
– – – – QAE: -CH2-N+-(CH3)3 Aniónico fuerte DEAE: -O-CH2-CH2-N+H-(C2H5)2Aniónico débil SP: -CH2-SO3- Catiónico fuerte CM: -O-CH2-COO- Catiónico débil

• La característica de intercambiador fuerte o débil hace referencia a la variación de ionización (capacidad) de la matriz con el pH, no a fuerza de union.

Cromatografía de intercambio iónico
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• La matriz debe tener poro grande para no actuar como tamiz molecular (Sepharose Fast Flow, límite de exclusión de 4 x 106)

• Siembra de la muestra:
– En el buffer de estabilización, baja fuerza iónica (Ej: Tris 20 mM)

• Métodosde elución:
– Variando el pH de la fase movil. – Aumentando la fuerza iónica de la fase movil (ej: ClNa 1M)

• Ventajas:

Cromatografía de intercambio iónico
– Alta capacidad – Alta resolución – Paso concentrador: puedo sembrar un gran volumen para luego eluirlo en un menor volumen

• Desventajas:
– Ocasionalmente las condiciones de la corrida pueden afectar la actividad de la proteínaCromatografía de intercambio iónico
Cromatograma representativo

Cromatoenfocado
Fundamento: separa biomoléculas de acuerdo a su pI Puede ser analítica o preparativa Ventajas: -Alta resolución (hasta diferencias de 0.02 unidades de pH) Desventajas: - Puede desnaturalizar las proteínas por la cercanía al pI

Interacción Hidrofóbica- Fase reversa
• Principio: técnicas adsortivas que sebasan en
interacción de tipo hidrofóbica entre la matriz y las proteínas • Grupos hidrofóbicos unidos a la matriz de sílica:
– Butilo (Butil Sepharose 4 FF) – Octilo (Octil Sepharose CL-4B) – Fenilo (Phenyl Superose)

Interacción Hidrofóbica
• Siembra: – Alta fuerza iónica (> 1M SO4(NH4)2) • Método de elución: – Disminuyendo la fuerza iónica de la fase movil (20 mM fosfato de sodio)....