Trabajos

Revisión de: ALTERATIONS IN THE DNA TOPOISOMERASE IV GRLA GENE RESPONSIBLE FOR QUINOLONE RESISTANCE IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS
YAMAGISHI J., KOJIMA T., OYAMADA Y., FUJIMOTO K., HATTORI H., NAKAMURA S. y INOUE M

01 de marzo de 2013

La tecnología del ADN recombinante permite el aislamiento y manipulación de un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro, haciendo uso deherramientas moleculares posteriores al aislamiento de un fragmento particular. Esto ha brindado sólidos conocimientos acerca de la expresión de genes de diversas especies, desde organismos unicelulares hasta organismos complejos como el ser humano. En el artículo en revisión, se aislaron tres fragmentos de ADN a partir de S. aureus meticilino resistente, que confiere resistencia a las quinolonas.Posteriormente se transformaron cepas de S. aureus con los fragmentos clonados. Con ello, se reportó que el gen mutado de grlA, es el responsable de la resistencia a las quinolonas, unos compuestos con una amplia y potente actividad antibacteriana.

INTRODUCCIÓN
El estudio de genes y proteínas, su secuencia y expresión; el diagnóstico de trastornos en la genética humana, la ubicación cromosómica degenes clonados, entre otros, son aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante. Esta, agrupa diversas técnicas cuyo objetivo es obtener una molécula o célula a partir de otra. Inicialmente, el fragmento de ADN de interés es amplificado haciendo uso de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Esta técnica es una imitación de la replicación del ADN. A partir de una secuencia diana seamplifican millones de copias de ADN en un corto período de tiempo. En cada ciclo de PCR primero, las dos cadenas de ADN deben separarse; de igual modo que la helicasa en la replicación del ADN separa las dos cadenas de nucleótidos, en la PCR se aplica calor con el mismo fin; posterior a esto se deben unir los primers (oligonucleótidos cortos de ADN de cadena simple) para servir como anclaje de laADN polimerasa, la cual se encargará de sintetizar una cadena complementaria a partir de la hebra molde. Cada una de estas etapas debe realizarse a unas temperaturas óptimas.
Una vez el gen es clonado, su secuencia puede ser conocida por medio del método de secuenciación por terminación de cadena, la cual utiliza nucleótidos modificados llamados didesoxirribonucleotidos, adicional a losdesoxirribonucleótidos, esta técnica es útil para identificar mutaciones genéticas, deducir la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por un gen clonado, entre otros. Estos fragmentos clonados pueden ser ligados en un plásmido, el cual será introducido en bacterias por técnicas de transformación como electroporación y choque térmico1.
En el artículo en revisión, el objetivo del autor fueaislar las secuencias de ADN que le confieren a S. aureus resistencia a las quinolonas, partiendo de los genes reportados: norA, gyrA, gyrB, fl1A y grlA. A partir de esto y haciendo uso de las técnicas anteriormente descritas, se determinó que los genes que codificaban proteínas homologas a la ADN girasa son el grlB y el gen mutado grlA, y que éste último es el responsable de la resistencia aquinolonas en S. aureus meticilino resistente.

MATERIALES Y MÉTODOS
Para llevar a cabo el análisis se emplearon técnicas de ADN recombinante como: transformación, PCR, mutagénesis dirigida; entre otras para seleccionar las cepas de interés. Además los compuestos empleados para identificar la resistencia en S. aureus transformante fueron: sparfloxacino, norfloxacino, ciprofloxaxino,ampicilina, cloranfenicol, kanamicina y novobiocina.
Cepas bacterianas y plásmidos: S. aureus KMP9, una cepa resistente a meticilina que tiene una alta resistencia a quinolonas, aislada en Kitasato Hospital en 1992. S. aureus RN4220 es una cepa de laboratorio susceptible a quinolonas. E. coli HB101 y el plásmido pUC19 fueron adquiridos de Takara Shuzo Co., Ltd. (Kyoto, Japón), y el plásmido pUB110 se...