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Reduca (Biología). Serie Técnicas y Métodos. 4 (3): 33-47, 2011.
ISSN: 1989-3620

Curso de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC):
Prácticas de laboratorio y cuestiones teórico-prácticas.
Parte II.
Práctica de laboratorio: análisis cuantitativo básico
Eva María Díaz Peña. Mara Sacristán San Cristóbal.
Borja Alarcón Aguareles. Carlos Vicente Córdoba.
María Estrella Legaz González.Departamento de Biología Vegetal I (Fisiología Vegetal). Facultad de Biología.
Universidad Complutense de Madrid. Avenida José Antonio Novais, 2. 28040 Madrid. España.
evam.diaz@bio.ucm.es
marasacristan@bio.ucm.es
borjaestremera@hotmail.com
cvicente@bio.ucm.es
melegaz@bio.ucm.es.

Resumen: En la práctica que se plantea, el alumno realiza dos tipos de calibración, una
absoluta y otra relativa quepermiten cuantificar un analito cuya concentración en la
muestra problema se desconoce. En la calibración absoluta se emplean
concentraciones crecientes de ácido p-hidroxibenzoico analizando la respuesta del
detector. En el caso de la calibración relativa se emplean concentraciones crecientes
de ácido gálico en presencia de una concentración fija de ácido p-hidroxibenzoico que
actúa como patróninterno.
Palabras clave: Analito. Columna analítica. Cuentas de área. Detector. Fase
estacionaria. Fase móvil. HPLC. Masa inyectada. Tiempo de retención.

INTRODUCCIÓN

Desde la incorporación de modernos detectores a la salida de la columna y el
acoplamiento de sistemas de integración, la técnica de HPLC ofrece la posibilidad de
realizar análisis cuantitativos. Los sofisticados sistemas de integraciónproporcionan
resultados de forma rápida y relativamente sencilla. Sin embargo, es importante
resaltar que la decisión final sólo puede ser tomada por el usuario experto en
cromatografía, quien analizará toda la información contenida en el cromatograma.
El pico cromatográfico representa una Gaussiana, que es una distribución de las
moléculas que eluyen a lo largo del tiempo. La cuantificación delpico conlleva la
evaluación del número de moléculas de cada soluto (cada pico) y, por tanto, la
cantidad o concentración de la misma. El análisis cuantitativo se basa en la
comparación de la altura, o el área, del pico del analito con la de uno o más patrones
inyectados bajo las mismas condiciones cromatográficas. El uso de una u otro
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ISSN: 1989-3620

dependerá de las características de la banda obtenida, altura en el caso de picos muy
agudos y, normalmente, área. Siempre y cuando la resolución (Rs) sea adecuada, el
área del pico es el parámetro cuantitativo fundamental. Ésta se mide, bien
triangulando el pico, como se comentó en la Práctica del cálculo de la eficiencia o
mediante un sistema de integración digitalelectrónico en línea con un ordenador. Para
realizar un buen análisis cuantitativo hay que tener en cuenta dos aspectos
fundamentales: correcto calibrado del equipo instrumental y las posibles causas de
error en las mediciones. Teniendo estos dos aspectos controlados, existen cinco
métodos de análisis cuantitativo que se discuten brevemente a continuación.
Calibración directa, absoluta, o de patrónexterno
Para realizar el cálculo de la composición de la muestra, se inyectan masas
exactas y conocidas de analito puro (patrón) y se determina su área (A p). A
continuación se hace una gráfica relacionando el área del pico (Ap) con su masa (mp),
obteniendo entonces una curva de calibración que debe ser lineal y pasar por el origen
del eje de coordenadas (Fig. 1). Así se realizará después con cada uno delos patrones.
Ecuación de la recta
Ap

Ap =K mp

Pendiente
K

mp

Figura 1. Recta de calibración directa.

Se inyecta entonces una masa exacta de la muestra problema (mx) y se
determina el área del componente a analizar (Ax). La masa de cada componente se
obtendrá interpolando el valor del área en la ecuación correspondiente a cada patrón,
de forma que:
mp = Ap/K
Normalización de área
Como...