actividad enzimatica de amilasa

Trabajo Práctico Nº 5:
Actividad enzimática de la α-amilasa
Introducción
Las enzimas son moléculas que funcionan como catalizadores biológicos, es decir, aceleran las reacciones químicas disminuyendo la energía de activación de las mismas. La reacción enzimática está caracterizada por la presencia de un sustrato, cuya cantidad irá desapareciendo a lo largo de la reacción apareciendo en sulugar, un producto. Cada enzima tiene condiciones óptimas de funcionamiento, para evidenciar la actividad de las mismas se pueden utilizar tests colorimétricos, absorbancia de la luz a determinada longitud de onda, sustratos marcados radiactivamente; o bien se pueden cambiar (de a una por vez) las condiciones de trabajo (pH, temperatura) para evaluar como inciden dichas modificaciones en laactividad de la enzima.
Objetivo
Estudiar la actividad enzimática de la α-amilasa salival y caracterizar dicha actividad cuando se somete a distintas condiciones, ya sean tratamientos o pre-tratamientos.
Desarrollo
En este trabajo práctico utilizamos como sustrato al almidón, polisacárido formado por: amilosa y amilopectina (que están, a su vez, formadas por moléculas de glucosa); para estudiar laactividad de la α- amilasa. Esta enzima rompe uniones entre los C1 y C4 de dos glucosas generando como producto dextrinas (oligosacáridos) de glucosa en este caso.
Para medir la actividad de la enzima utilizamos un test colorimétrico a partir de una solución de Lugol (I₂ en equilibrio con KI, con agua destilada) para detectar la desaparición del sustrato. El almidón, en presencia de una soluciónde iodo presenta un color azulado debido a la interacción entre las moléculas de amilosa y el iodo, por lo tanto la disminución de la intensidad del color indicaba la desaparición del sustrato (ya que el producto no reacciona de la misma manera frente al iodo). Esto se evaluó en función del tiempo hasta la desaparición del sustrato, es decir, ausencia de color azul en la solución (efectoacromático). La solución de Lugol, además, detiene la reacción de degradación del almidón al inactivar la -amilasa, lo cual resulta útil para comparar los distintos estadios de la reacción (Proceso de “revelado”).
Este procedimiento se realizó nuevamente cambiando una variable relacionada con la actividad óptima de la enzima. Se hicieron tratamientos (pH, temperatura y concentración de la actividadenzimática) y pre-tratamientos (calor y proteinasa), a nosotros nos asignaron 2 tratamientos: efecto del pH básico y la concentración de cloruro de sodio sobre la actividad enzimática.

1. Recolección de la saliva:
Un voluntario de nuestro grupo recolectó una muestra de saliva de aproximadamente 3 ml y medimos su pH con papel indicador, el cual estuvo entre 7,2 y 7,5.
2. Dilución óptima y tiempo dereferencia:
Primero utilizamos una dilución de 1/10 (500l de saliva + 4,5 ml de agua) y seguimos las indicaciones para determinar el tiempo de referencia. Esta concentración resultó ser muy diluida, ya que el color desapareció por completo a los 10 minutos de iniciada la reacción (nos indicaron que estuviera entre 3 y 8 minutos, a los fines de que el experimento no se prolongara demasiado).
Poresta razón realizamos una segunda dilución de 1/5 (500l de saliva + 2 ml de agua) que estuvo dentro del rango mencionado. El efecto acromático se produjo a los 6 minutos (tiempo de referencia).
Para determinar el tiempo de referencia y la dilución óptima se tomó una alícuota de la reacción de 60l cada 30 segundos y se la colocó en distintos tubos de ensayo con solución de Lugol. El tiempo cerocorresponde a la solución de almidón antes de mezclarla con la enzima.
El tiempo de referencia y la dilución óptima son patrones determinados arbitrariamente, necesarios para comparar los siguientes experimentos con cambio de alguna de las variables y hacer deducciones. Por ejemplo, una reducción en el tiempo de desaparición del color puede indicar un aumento en la actividad enzimática en...