Aislamiento De Hongos Fitopatogenos
Páginas: 5 (1173 palabras)
Publicado: 26 de septiembre de 2012
AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATÓGENOS
Cortes: Para iniciar el proceso de aislamiento y cultivo se cortan trozos de tejido, de más o menos 2 mm de ancho por 3.5 mm de largo. Estos trozos se sacan de aquellas partes en donde las lesiones no estén muy avanzadas. Es recomendable además sacarlos de los bordes de las lesiones, para incluir parte sana y parte afectada, y tratar así de evitar lapresencia de agentes contaminadores.
Desinfección: Efectuados los cortes de tejido es recomendable desinfectarlos; para ello se sumergen de 1 a 2 minutos en alcohol (preferiblemente del 70 %) y luego 1 a 3 minutos en una solución de hipoclorito de sodio al 0.5%; por último se lavan dos o tres veces con agua destilada estéril.
Siembra: El siguiente paso, terminada la desinfección, es la siembra.Para efectuarla, los cortes de los tejidos desinfectados se toman con una pinza esterilizada y se transfieren a cajas de petri que contengan algún medio de cultivo esterilizado.
Medio de Cultivo: El más usado es el PDA y para impedir el crecimiento de bacterias contaminadoras puede ser acidificado con ácido láctico al 25%, a razón de 2-5 gotas por cada caja petri según sea el tamaño de la caja yel volumen de medio de cultivo por caja; sin embargo hay que anotar que el ácido láctico impide el crecimiento de muchas bacterias pero no de todas.
Otros medios de cultivo son Czapek, Malt Agar, V-8 (jugo de vegetales), HFDA (hojas de frijol, dextrosa y agar).
Para esterilizar el medio de cultivo se coloca en un autoclave a 121 ºCy 15 libras de presión durante 15 minutos. Usualmente loshongos crecen mejor en medios ricos en carbohidratos y con un pH entre 6 y 6.5.
Una vez realizada la siembra, las cajas de petri deben guardarse en una incubadora. En general las temperaturas ideales para el desarrollo óptimo de los hongos varían entre 14 y 28 ºC, dependiendo de las condiciones ambientales del lugar de recolección de la muestra. Tan pronto haya micelio suficientementedesarrollado, se procede a transferir parte de éste a una nueva caja de petri con PDA, para evitar la proliferación de aquellos agentes contaminadores que hayan resistido la desinfección y que debido a su crecimiento más rápido puedan impedir el desarrollo adecuado del hongo.
Ya en la nueva caja de petri el hongo se somete una vez más al proceso de incubación hasta lograr la formación o el desarrollo delas estructuras características.
Identificación: Luego de tener el hongo aislado y en crecimiento se precede a observarlo. Se debe hacer una observación macroscópica y microscópica.
Observación Macroscópica: La identificación del hongo aislado se puede lograr con base en la observación macroscópica de la colonia. Esta observación permite determinar las siguientes características:
Aspectode la colonia: Algodonoso, como en el caso de especies de Fusarium y Alternaria, Pestalotia sp. y Botrytis cinerea. Plumoso, como en el de Colletotrichum sp., Rhizopus sp. y Phoma sp.
Pigmentación de la colonia: De color blanco, como la de Rhizopus sp. Negra, como la de Colletotrichum acutatum. De color variable, entre rojo y violeta, como la de Fusarium spp. El aspecto y la pigmentación delas colonias dependen mucho del contenido de nutrientes del medio de cultivo.
Observación Microscópica: La identificación también puede hacerse en base en la observación microscópica de determinadas características del hongo. Por ejemplo:
Las conidias de Alternaria sp.
Las conidias de Colletotrichum acutatum
Las conidias de Fusarium sp.
1. TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN1. AISLAMIENTO DE HONGOS
El aislamiento consistirá en limpiar con un algodón embebido en alcohol 70% el tejido vegetal enfermo, realizar pequeños cortes de la zona de avance de la infección, donde el patógeno está en activo desarrollo. Los trozos serán esterilizados con una solución de hipoclorito al 1% durante 1 minuto, enjuagados con agua destilada estéril.
Posteriormente...
Cortes: Para iniciar el proceso de aislamiento y cultivo se cortan trozos de tejido, de más o menos 2 mm de ancho por 3.5 mm de largo. Estos trozos se sacan de aquellas partes en donde las lesiones no estén muy avanzadas. Es recomendable además sacarlos de los bordes de las lesiones, para incluir parte sana y parte afectada, y tratar así de evitar lapresencia de agentes contaminadores.
Desinfección: Efectuados los cortes de tejido es recomendable desinfectarlos; para ello se sumergen de 1 a 2 minutos en alcohol (preferiblemente del 70 %) y luego 1 a 3 minutos en una solución de hipoclorito de sodio al 0.5%; por último se lavan dos o tres veces con agua destilada estéril.
Siembra: El siguiente paso, terminada la desinfección, es la siembra.Para efectuarla, los cortes de los tejidos desinfectados se toman con una pinza esterilizada y se transfieren a cajas de petri que contengan algún medio de cultivo esterilizado.
Medio de Cultivo: El más usado es el PDA y para impedir el crecimiento de bacterias contaminadoras puede ser acidificado con ácido láctico al 25%, a razón de 2-5 gotas por cada caja petri según sea el tamaño de la caja yel volumen de medio de cultivo por caja; sin embargo hay que anotar que el ácido láctico impide el crecimiento de muchas bacterias pero no de todas.
Otros medios de cultivo son Czapek, Malt Agar, V-8 (jugo de vegetales), HFDA (hojas de frijol, dextrosa y agar).
Para esterilizar el medio de cultivo se coloca en un autoclave a 121 ºCy 15 libras de presión durante 15 minutos. Usualmente loshongos crecen mejor en medios ricos en carbohidratos y con un pH entre 6 y 6.5.
Una vez realizada la siembra, las cajas de petri deben guardarse en una incubadora. En general las temperaturas ideales para el desarrollo óptimo de los hongos varían entre 14 y 28 ºC, dependiendo de las condiciones ambientales del lugar de recolección de la muestra. Tan pronto haya micelio suficientementedesarrollado, se procede a transferir parte de éste a una nueva caja de petri con PDA, para evitar la proliferación de aquellos agentes contaminadores que hayan resistido la desinfección y que debido a su crecimiento más rápido puedan impedir el desarrollo adecuado del hongo.
Ya en la nueva caja de petri el hongo se somete una vez más al proceso de incubación hasta lograr la formación o el desarrollo delas estructuras características.
Identificación: Luego de tener el hongo aislado y en crecimiento se precede a observarlo. Se debe hacer una observación macroscópica y microscópica.
Observación Macroscópica: La identificación del hongo aislado se puede lograr con base en la observación macroscópica de la colonia. Esta observación permite determinar las siguientes características:
Aspectode la colonia: Algodonoso, como en el caso de especies de Fusarium y Alternaria, Pestalotia sp. y Botrytis cinerea. Plumoso, como en el de Colletotrichum sp., Rhizopus sp. y Phoma sp.
Pigmentación de la colonia: De color blanco, como la de Rhizopus sp. Negra, como la de Colletotrichum acutatum. De color variable, entre rojo y violeta, como la de Fusarium spp. El aspecto y la pigmentación delas colonias dependen mucho del contenido de nutrientes del medio de cultivo.
Observación Microscópica: La identificación también puede hacerse en base en la observación microscópica de determinadas características del hongo. Por ejemplo:
Las conidias de Alternaria sp.
Las conidias de Colletotrichum acutatum
Las conidias de Fusarium sp.
1. TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN1. AISLAMIENTO DE HONGOS
El aislamiento consistirá en limpiar con un algodón embebido en alcohol 70% el tejido vegetal enfermo, realizar pequeños cortes de la zona de avance de la infección, donde el patógeno está en activo desarrollo. Los trozos serán esterilizados con una solución de hipoclorito al 1% durante 1 minuto, enjuagados con agua destilada estéril.
Posteriormente...
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