Aislamiento Y Fragmentacion De Adn

Páginas: 5 (1084 palabras) Publicado: 23 de mayo de 2012
UNION A VECTORES DE CLONACION

Los vectores de clonación son pequeños elementos genéticos (moléculas de ADN) utilizados para recombinar y replicar genes  que faciliten el transporte de segmentos d ADN a otra célula (plásmidos, fagos, etc)
▪ Cortar el vector con enzimas de restricción, las mismas enzimas que se utilizaron  para cortar el ADN que se quiere insertar.
▪ Unir el vector y el ADNque se va a clonar mediante los llamados extremos cohesivos, o pegajosos, o escalonados.
 

El vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto.
Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.
En bacterias (células procariotas), mediante estosprocesos:
Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos.
La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introducen en su interior y las incorpora a su genoma.

Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadoramediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.

* En la figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poropor donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.

AISLAMIENTO Y FRAGMENTACION
    El primer paso consiste en aislar pequeños fragmentos de  ADN que contengan los genes a clonar.
Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y concentrarse.
·          Partimos de células con núcleo, que deben ser lisadas (rotas).
·          Lasproteínas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares deben separarse del ADN.
·          El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por acción de las enzimas de restricción.
·          Se aísla el ADN que se desea clonar.

Las secuencias reconocidas por las restrictasas suelen ser palindrómicas, es decir, capicúas, y en muchos casos las enzimas las cortan dejando cadenas con extremos dediferente longitud, como se aprecia en la imagen:

Los extremos de este corte reciben el nombre de "cohesivos" porque actúan, en cierto sentido, como "tiras de velcro": las zonas no apareadas se complementan con las de otra molécula de ADN cortadas con la misma enzima, de modo que si se ponen juntos dos fragmentos de ADN cortados con la misma restrictasa (y esta deja fragmentos cohesivos), losextremos de dichos fragmentos se unirán entre sí espontáneamente, permitiendo que vuelvan a unirse.
En general, el ADN aislado se corta con una enzima de restricción que proporcione extremos cohesivos. Si se conoce la secuencia del gen, se trata de seleccionar una restrictasa que no corte la secuencia del gen. Existe un número considerable de restrictasas, cuya secuencia de corte es conocida, loque facilita bastante el trabajo en este caso.

l gen que se busca es uno de los miles de fragmentos que se han obtenido en el proceso de corte. La individualización de los fragmentos de ADN se hace utilizando técnicas de separación, en especial la electroforesis en gel de agarosa. Esta técnica aprovecha el hecho de que el ADN esté cargado eléctricamente a pH fisiológico. Si se aplica un campoeléctrico a una mezcla de moléculas de ADN éstas se mueven hacia el polo positivo, a una velocidad que es inversamente proporcional a su tamaño. De este modo, haciendo correr esas moléculas a través de un gel durante un tiempo fijo es posible separar las moléculas en función de su longitud.

La electroforesis en gel permite separar entre sí los fragmentos de ADN según su tamaño, lo que facilita...
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