AISLAR EL ADN

Objetivos -Aislar el complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-protena) a partir de timo de ternera -Disociar el complejo en sus dos componentes DNA y protenas -Precipitar desoxirribonucleato de sodio. -Disolver desoxirribonucleato de sodio obtenido. Introduccin ELECCION DEL TEJIDO Con el objeto de elegir tejido biolgico adecuado para la obtencin del ADN, se deben considerar algunos requisitos,entre los que se puede mencionar los siguientes 1) Elevada concentracin de ADN. 2) Mnima relacin ARN/ADN 3) Baja actividad de ADNasa. 4) Elevado contenido ADN/rgano. 5) Fcil disponibilidad. 6) Bajo costo. 1) Elevada concentracin de ADN. Casi todas las clulas contienen ADN excepcionalmente, algunas de ellas carecen de ncleo y tambin de ADN, como en el caso de los glbulos rojos de los mamferos. Enlas clulas nucleadas, la cantidad de ADN vara notablemente en los diferentes tejidos. Como ejemplo, consideremos el contenido de ADN de los diferentes tejidos de una rata adulta TEJIDOg de ADN/100 mg de tejido fresco msculo esqueltico57cerebro123testculo230hgado240vescula seminal254corazn306rin324pncreas480pulmn710intestino delgado1290bazo1400mdula sea1530timo2760 En esta tabla se observa que, en larata adulta el rgano ms rico en ADN es el timo (concentraciones algo menores se encuentran en la mdula sea, el bazo y el intestino delgado.). 2) Mnima relacin ARN/ADN La presencia de elevadas concentraciones de ARN dificulta el aislamiento del ADN por tratarse de compuestos estrechamente relacionados desde el punto de vista qumico. En general las clulas vivas contienen una cantidad de ARNconsiderablemente mayor que la de ADN. Un caso extremo lo constituye el ovocito de los anfibios en el que la relacin ARN/ADN es 31,76 en el extremo opuesto podemos ubicar a las clulas espermticas que estn casi exclusivamente constituidas por ADN. En la siguiente tabla vemos como vara esta relacin en los diferentes tejidos de la rata adulta TEJIDOARN/ADNhgado3,68glndulasub-maxilar1,73rin1,08bazo0,335tejido linfoide0,285timo0,195 Bajo este aspecto, tambin el timo se encuentra en las mejores condiciones. 3) Baja actividad de ADNasa Los extractos de distintos tejidos como el hgado, bazo y timo tienen la propiedad de licuar los geles de ADN debido a la presencia de la desoxirribonucleasa, enzima que interviene especficamente en la degradacin del ADN la ADNasa es una fosfodiestearasa altamenteespecfica. Para su accin esta enzima requiere la presencia de cationes bivalentes los activadores ms especficos son los iones magnesio, manganeso, hierro y cobalto todos ellos son muy parecidos con respecto a la intensidad de la accin que producen. Los inconvenientes derivados de la presencia de desoxirribonucleasa en los tejidos puede evitarse mediante el empleo de inhibidores de esta enzima. Entreellos se encuentran las sustancias que extraen los cationes como los aniones citrato y fluoruro, los agentes quelantes como el EDTA (etilen diamino tetraacetato) los iones cobre y arseniato, fuertemente inhibidores a una concentracin de 0,001 M y el borato a 0,02 M. 4) Elevado contenido en ADN/rgano. Es muy importante que la concentracin del ADN en el tejido sea elevada pero desde el punto de vistaprctico, el material biolgico ser ms ventajoso si la cantidad total del ADN en el rgano es tambin alta. Daremos un ejemplo Por lo que se ha visto hasta ahora, el timo es el rgano de la rata que rene las mejores condiciones para la obtencin de ADN pero ste es un rgano pequeo pesa aproximadamente 33 mg, por lo tanto se obtiene menos de 1 mg de ADN. En el timo de ternera la concentracin del ADN esaproximadamente la misma (2250 g ADN/100 mg de tejido), pero tiene un tamao mucho mayor pesa aproximadamente 500 g y se pueden obtener de l ms de 100 mg de ADN, cantidad para la cual se deberan sacrificar unas 100 ratas adultas. 5) Fcil disponibilidad No basta con que el material biolgico rena todas las caractersticas que vimos anteriormente es necesario tambin que sea fcil de obtener en el...