analitica

Extracción y purificación de glucosa oxidasa para fines diagnósticos producida en medios a base de fertilizantes y azúcar industrial.
La glucosa oxidasa es una glicoproteína dependiente de FAD, que cataliza la oxidación de la β-D-glucosa, por la vía del D-glucano-δ-lactona, hacia ácido glucónico y peróxido de hidrógeno, usando el oxígeno molecular como aceptor final de electrones. Es muyutilizada a nivel industrial, es un aditivo importante para la conservación de alimentos y forma parte de los reactivos para determinación de glicemia y otros parámetros paraclínicos. Las primeras extracciones fueron realizadas por Müller en 1928, a partir de las cepas Aspergillus niger y Penicillium glaucum, posteriormente se han encontrado muchas especies productoras. Los sustratos que se utilizanpara el cultivo, son muy variables y van desde fuentes complejas como: suero de queso, licor de maíz, melazas, hidrolizados proteicos; hasta fuentes definidas como: glucosa y sales minerales.
En esta investigación se planteó, producir GOX a partir de A. niger usando sustratos complejos como el azúcar industrial y algunos fertilizantes, y probar su efectividad en la determinación de concentraciónde glucosa.
MATERIALES Y REACTIVOS
Microoganismos
Cultivos en fiola
Se establecieron 4 tipos de medios de cultivo y se probaron en cultivos de 50 mL, a fin de evaluar el crecimiento y la actividad enzimática exportada al caldo de fermentación. Como medio estándar (Est) se utilizó uno a base de glucosa y sales minerales [4]. Los medios alternativos fueron elaborados siguiendo la formulaciónde éste, haciendo sustitución de al menos 2 de los constituyentes. En todos los casos la glucosa se sustituyó por azúcar industrial (sacarosa) y al menos una de las sales nutritivas fue sustituida por un fertilizante comercial (Tabla 1).
Cultivos en biorreactores
Para la producción y purificación de la enzima, se llevaron a cabo cultivos en un biorreactor de 5 L (New Brunswick, ModeloBioflo 2000). Las condiciones de incubación fueron similares, 30ºC con suministro de aire a razón de 2 L/min por 36 h con una agitación de 200 rpm, monitoreando los cambios de peso, pH y consumo de oxígeno durante el tiempo de incubación. La recuperación se realizó por filtración y al extracto crudo obtenido se le determinó el contenido proteico y la actividad enzimática, antes de someterlo a losprocesos de extracción y purificación.
Contenido proteico
Para la estimación se tomaron las lecturas de absorbancia de las muestras, a las longitudes de 260 y 280 nm y aplicó la fórmula (1,55*Abs 280) – (0,76*Abs 260) [5]. El equipo utilizado para tomar las mediciones, fue un espectrofotómetro Beckman Modelo Du 650.
Actividad enzimática
La actividad de GOX se evaluó midiendo la producción deperóxido de hidrógeno a partir de glucosa colocada como sustrato en el ensayo. Para ello se utilizó la modalidad de acoplamiento con peroxidasa, usando la 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) como cosustrato [6]. La mezcla de reacción contenía 30 µL de TMB 0,4 g/L oxigenado por 10 min; 1,4 µl de una solución de peroxidasa de 4,3 mg/mL en de buffer fosfato 0,05 M pH:6,9; 5 µL de de β-D-glucosa 4 mM;y 0,1-0,2 µg de proteínas de cada muestra diluidas en un determinado volumen de buffer fosfato 0,05M (pH 7). Esta mezcla se incubó por 10 minutos a 25 ºС y la reacción se detuvo agregando 50 µL de HCl 0,1 N. Las lecturas de absorbancia se realizaron a 450 nm (máximo de absorbancia del producto de oxidación del TMB) y los resultados se expresaron tanto en variación de la absorbancia por unidad devolumen (∆Abs450nm/ml) como en unidades de actividad. Para el cálculo de éstas se utilizó el coeficiente de extinción molar del TMB (5,9x104 M-1 cm-1) y se definió como la cantidad de glucosa oxidasa que cataliza la oxidación de 1 µmol de α-D-glucosa por minuto a pH 7 y a 25°C.
Técnicas de extracción y purificación
En esta investigación se trabajó con la enzima extracelular, por lo que la...