Aorta De Bovino

| FACULTAD DE CIENCIASLABORATORIOS DE BIOQUIMICAREPORTE ENZIMAS |

PARTE I
Objetivo: determinar el pH óptimo de la enzima fosfatasa ácida de aorta de bovino.

Siguiendo los pasos indicados en la guía de laboratorio y lo que se indica en la tabla 1, Ud. podrá determinar el pH óptimo donde la enzima presenta la mayor actividad enzimática.

Tabla 1. Protocolo para la preparación desoluciones con distintos valores de pH.

Volumen (mL) | Tubo B | Tubo C | Tubo 1 | Tubo 2 | Tubo 3 | Tubo 4 | Tubo 5 |
p-nitrofenilfosfato | - | 1,0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
MgCl2 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
buffer citrato | 0 | 0 | 2.5 (pH 3.0) | 2.5(pH 4.5) | 2.5(pH 5.6) | 2.5(pH 7.5) | 2.5(pH 9.0) |
H2O | 4.5 | 4.5 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
Enzima |1.0 | 0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |

Rotule los tubos de ensayo según corresponda y proceda a incubar a 37°C por el tiempo que le indiquen los profesores de laboratorio.

Para cada tubo debe agregar la enzima al final, luego de mezclar todos los reactivos. Explique el porqué de este paso.

Esto se utiliza con el fin de preparar soluciones en el cual existen diferentes pH 3.0, 4.5,5.6, 7.5, 9.0, los que llevaran a la enzima a tener una actividad enzimática, logrando adquirir una velocidad máxima de reacción, a través de un pH óptimo. |

Luego de la preparación de los distintos tubos con diferentes valores de pH proceda a determinar la absorbancia para cada uno de ellos como se lo indicará su profesor de laboratorio y anote este valor en la tabla 2.

Para ello Ud.debe saber que la concentración de producto formado por una enzima se calcula con la fórmula: C= ABS/ ε L. Donde ε=17500 M-1 cm-1, L= 1 cm.

Recuerde que en esta actividad práctica la enzima fosfatasa ácida forma el producto llamado p-nitrofenol.
Y la velocidad de reacción de una enzima se calcula con la fórmula: velocidad = [p-nitrifenol] / Δt. Donde Δt es el tiempo de incubación.

Tabla2. Valores de absorbancia, concentración de producto formado y velocidad de reacción de la enzima fosfatasa ácida de bovino.

Tubo | Ph | ABS | ABS corregida | [p-NPP] Mm | VEL Mm/min |
B |   | 0.000 |   |   |   |
C |   | 0.011 |   | 0.00062 |   |
1 | 3,000000 | 0.067 | 0.056 | 0.0032 | 0,000160 |
2 | 4,500000 | 0.493 | 0.482 | 0.0275 | 0,001370 |
3 | 5,600000 | 0.577 | 0.566 | 0.032| 0,001600 |
4 | 6,200000 | 0.555 | 0.544 | 0.031 | 0,001550 |

Ph | vel |
3,00 | 0,16 |
4,50 | 1,37 |
5,60 | 1,6 |
6,20 | 1,55 |

Luego de realizar los cálculos de la velocidad de reacción de la fosfatasa ácida, proceda a graficar los datos (gráfico velocidad v/s pH).



Gráfica 1. La actividad catalítica de la enzima fosfatasa ácida depende del pH.Discusión:

a) Mencione sustrato(s), enzima, producto(s) que participan en la reacción estudiada.

Sustrato (s): Como sustrato se utilizará p-nitrofenilfosfato, este al hidrolizarse genera paranitrofenol, el cual en estado de p-nitrofenolato (pH alcalino), presenta un color amarillo pudiendo cuantificarse por espectrofotometría.
Enzima: Aorta de bovino de esta se extrae una fosfomonoesterasano específica cuyo pH óptimo está en el rango ácido (fosfatasa ácida).
Productos: p-nitrofenol, fosfata ácida de coloración amarilla.

b) Explique qué tipo de reacción lleva a cabo esta enzima.
Se une el grupo fosfato a un grupo oH de un residuo de serina del sitio activo de la fosfomonoesterasa, y el intermediario se hidroliza, generando una enzima

c) ¿Cómo es la variación de lavelocidad de reacción en función del pH?
La mayoría de las enzimas logran su actividad enzimática en base a pH óptimos, por lo tanto a valores superiores o inferiores del pH óptimo, la actividad enzimática puede disminuir, dado que algunas cadenas laterales de aminoácidos pueden actuar como ácidos o bases débiles que desarrollan funciones críticas en el sitio activo de la enzima y que dependen...