Bioquimica G-100

Cromatografía de Exclusión Molecular o Permeación en Gel
Objetivo:
Familiarizarse con el uso de las resinas de exclusión o tamices moleculares. Su utilización para caracterización de pesomolecular.
Resumen:
La cromatografía de permeacion en gel es un método de purificación de polímeros naturales y sintéticos, que separa moléculas en función de sus tamaños moleculares. La matriz sólida que seva a utilizar en la practica esta constituida por un polímero de dextrano entrecruzado con epiclorhidrina. Es un polisacárido altamente hidrofilico, al igual que el almidón, que se hincha en contactocon un solvente acuoso. Su nombre comercial es el de Sephadex G-100. Se fabrica en partículas esféricas porosas con distinto grado de entrecruzamiento y por lo tanto con diferentes capacidades deseparación de moléculas.
Las propiedades más importantes del Sephadex G-100 son;
• Separa proteínas en el rango de 4000 – 150000 Da
• Retiene una cantidad de agua de 10 ml +/- 1 ml por gramo deSephadex seco
• Su densidad es de 1.04g/ml
• La forma de gel se consigue por hidratación
Reactivos:
Sephadex G-100
Solución de NaCl 0.9 %
Buffer acetato 0,2 M (pH 6)
Solución de azul Dextrano: 0,3 %p/v en buffer
Solución de mioglobina: 0,1% p/v en buffer
Solución de Catalasa: 0,1 % p/v en buffer
Solucion de Albumina: 0.1% p/v en buffer
Solucion de Vitamina B12
Materiales e instrumental:Columna cromatográfica
pipetas
tubos de ensayo
Procedimiento:
Preparación de la columna
Se mezcla una cantidad adecuada de Sephadex con la fase movi l(NaCl 0.9%) para permitir la hidratación yformación del gel. Una vez hidratado se vierte dentro de la columna cromatografica poco a poco y sobre las paredes de la misma para evitar la formación de burbujas. La altura de la columna preparada debeser de aproximadamente 10 cm.A continuación se hace pasar suficiente cantidad de fase movil para lograr un buen empaquetamiento de la columna.
Es importante antes de verter el gel en la columna...