Biotecnologia

U.T 11 SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 1. INTRODUCCIÓN La secuenciación es el proceso que permite conocer el orden de los nucleótidos de un fragmento dado de ADN, a finales de los 70 sedesarrollaron métodos que permitieron determinarlo de manera rápida y sencilla: uno químico(Maxam y Gilbert) y otro enzimático(Sanger). Actualmente el más utilizado es el de Sanger junto con la secuenciaciónautomática. 2. MÉTODO ENZIMÁTICO DE TERMINACIÓN DE CADENA O MÉTODO DIDEOXI DE SANGER La cadena de ADN a secuenciar se utiliza como molde para la síntesis de una nueva cadena de ADN, marcado el sitio deinicio por un primer y catalizado por la ADN polimerase. Se emplea una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y dideoxinucleotido trifosfato (ddNTP). La incorporación de ddNTP o "terminador"bloquea la elongación de la cadena, originando así una poblaciíon de fragmentos de ADN truncados de diferentes longitudes. La identidad del nucleótido que finaliza la cadena en cada posición se determinaya sea realizando cuatro reacciones de elongaciones separadas, cada una con ddNTP diferente, o con una reacción de elongación combinando los cuatro ddNTP, pero marcando cada uno de ellos de formaespecífica. La población de moléculas resultantes se separa mediante electroforesis en gel de acrilamida, y la secuencia se obtiene correlacionando el orden de los fragmentos con el dideoxinucleótido conque termina cada uno de ellos. 2.1 INGREDIENTES DEL MÉTODO ENZIMÁTICO DE TERMINACIÓN DE CADENA    ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar: Se necesita tener gran cantidad de ADN, portanto se suele clonar previamente en un vector apropiado o por PCR Enzima: Normalmente se emplea la "Sequenase" Cebador o primer: Suele ser un oligonucleótido de 20 pares de base de longitud, susecuencia debe ser complementaria al fragmento de ADN que se quiere secuenciar. Ya que la secuencia que se quiere determinar es desconocida se emplea un primer con secuencia complementaria al vector donde...