Cloroplastos 1

 TURNO DE LABORATORIO: JUEVES 9 A 13HS NÚMERO DE GRUPO: 2 (DOS)
Cloroplastos

Trabajo Práctico Nº7



Integrantes del grupo:

Acevedo, Giselle
Massazza, Victoria
Peltzer, Morena
Yeginer, Camila



Fecha de entrega: 02/7/2015



Jefe de trabajos prácticos:
Cherñavsky, Alejandra.
Ayudantes:
Sampayo, Rocío
Godoy Herz, Micaela.



Resumen:
En esteexperimento se buscó visualizar, a través de un efecto acromático, la reacción de la absorción de luz daba como resultado la reducción del DCPiP y la liberación de oxigeno.
Introducción:
Algunos organismos tienen la capacidad de llevar a cabo una serie de procesos físicos, químicos y bioquímicos que involucran la captación y transferencia de energía lumínica y su almacenamiento en forma química.Estos procesos reciben el nombre de fotosíntesis.
La fotosíntesis es utilizada para transformar el CO2 de la atmósfera en hidratos de carbono, (CH2O)n. El tipo de fotosíntesis más abundante es la oxigénica, en la cual se consumen H2O, CO2 y luz para generar (CH2O)n y O2. Éste tipo de fotosíntesis es llevado a cabo por plantas, algas (todas eucariotas) y las cianobacterias.
En las células eucariotaseste proceso es llevado a cabo dentro de los cloroplastos. Estos están delimitados por dos membranas, la bicapa lipídica, y es por ello que se realiza el procedimiento de fraccionamiento sub- celular para obtener cloroplastos aislados del resto de los componentes celulares, que además son fotosintéticamente activos.
Durante la etapa lumínica de la fotosíntesis se produce la captación de energíalumínica y la transformación de la misma en energía química, en forma de ATP y compuestos reducidos. La maquinaria responsable de esta etapa consiste en un “complejo antena” que captan la energía lumínica y una serie de proteínas y moléculas orgánicas que están situadas en una misma membrana y que transfieren electrones desde el H2O hacia un aceptor final. El resultado de esta fase es eltransporte de electrones desde la molécula de agua hasta el NADP, siendo la luz quien proporciona la energía necesaria. Acoplada a este proceso de óxido reducción es que se produce la fosforilación del ADP. Entonces, los productos formados, el ATP y el NADPH + H+, son utilizados para realizar la fijación del CO2 en la etapa independiente de la luz de la fotosíntesis.
Para evaluar la actividadfotosintética de los cloroplastos en el laboratorio consiste en agregar un aceptor de electrones exógeno, cuya reducción sea simple de revelarse (como la utilización de un compuesto sintético capaz de cambiar de color según esté oxidado o reducido), este mecanismo recibe el nombre de reacción de Hill. La siguiente ecuación muestra cómo se da esta reacción:
H2O + DCPIP → DCPIP reducido + O2
Nota: la reacciónde Hill, también conocida como etapa lumínica de la fotosíntesis ocurre en el fotosistema II. El DCPIP oxidado es de color azul mientras que el DCPIP reducido es incoloro.

Objetivos:
Aislar cloroplastos de hojas de espinaca
Verificación de actividad fotosintética
Medir su actividad fotosintética mediante el efecto de los detergentes o las diferentes longitudes de onda

Metodología:
1-Aislación de cloroplastos: Para realizar la separación de los cloroplastos dentro de las células vegetales de la espinaca se trituraron las hojas de espinaca mezcladas con BH10 frio, el cual actuó como buffer de homogeneización. Luego de triturarlas en una licuadora, se filtro la solución obtenida con algodón y un embudo.
Por último se centrifugó la mezcla por 10 minutos a 4°C, lo que nos dio comoresultado un pellet con cloroplastos, el cual fue sumergido en 2ml de buffer BH10, un buffer de homogeneización con sacarosa (isotónico).
2- Preparación del gradiente de BH: Con cuidado colocamos 8 ml del buffer BH60 (con una concentración de sacarosa en 60%) apoyando la pipeta Pasteur contra la pared del tubo de ensayo para que corra despacio por esta. Luego agregamos 8 ml del buffer BH40 (con una...