¿Como se hace la prueba de adn?

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Cómo se hace un análisis de ADN?
1- Extracción del ADN
La muestra biológica (sangre, uñas, hisopados o cualquier otro tejido que contenga células humanas con núcleo) se somete a la acción de detergentes, que disuelven los lípidos; y enzimas proteolíticas, que cortan las proteínas.
Luego de incubar la mezcla una noche a 60 grados centígrados, se produce la ruptura de la estructura celularliberando todo su contenido a la solución.
La mezcla se limpia mediante sucesivos lavados con solventes orgánicos (fenol, cloroformo), que coagulan proteínas y extraen los lípidos, y finalmente el ADN se separa por precipitación con alcohol en medio salino.
Eventualmente, en los casos de manchas antiguas o huesos, se realizan purificaciones posteriores por diálisis o adsorción a soportes sólidos.Existen métodos alternativos en los cuales la muestra sanguínea se deposita sobre un papel especial, que la mantiene inalterada por años a temperatura ambiente. Previo al análisis, se cortan con un sacabocados pequeños fragmentos del papel (alrededor de 1 mm) y se extraen las impurezas mediante lavados. El papel así procesado, con el ADN adherido, se analiza directamente colocándolo en la mezcla deamplificación.

2- Análisis del ADN
Existen dos metodologías diferentes:
a) Corte con enzimas de restricción, corrimiento electroforético en geles de agarosa, transferencia a una membrana de nylon o celulosa y tratamiento con sondas de locus múltiple o de locus específico.
b) Amplificación mediante PCR o reacción en cadena de la polimerasa: es un proceso que consiste en imitar unaactividad normal de la célula: la copia de ADN, aunque en este caso limitado a pequeños fragmentos, en los cuales están ubicadas las regiones variables.
Para ello, se coloca en cada tubo una porción del ADN extraído de cada persona y una mezcla que contiene nucleótidos, sales, una enzima que "copia" ADN (denominada polimerasa) y los "primers" que reconocen la zona variable.

La mezcla se somete avariaciones de temperatura en un ciclador térmico, que produce sucesivamente tres temperaturas diferentes: una que desnaturaliza o separa las cadenas del ADN, otra que facilita que los "primers" reconozcan y se adhieran a la región a copiar, y la tercera que permite la extensión de la cadena copiada, mediante la unión de los nucleótidos que se encuentran en la solución, con la ayuda de la polimerasa.Luego, los amplificados se someten a un campo eléctrico en el interior de un soporte semisólido o gel (electroforesis). Como el ADN está cargado negativamente, se dirige hacia el polo positivo, los fragmentos pequeños más rápido que los grandes, produciendo su separación.
Finalmente, los fragmentos separados se visualizan mediante diferentes métodos:
- Radiactivos: si uno de los nucleótidosestaba marcado radiactivamente, basta poner el gel en contacto con una película radiográfica, que se revela para observar las variantes.
- Tinción con plata: se trata el gel con sales de plata, que por su carga positiva son atraídas por la carga negativa de los fragmentos de ADN, y se revela de modo similar a una fotografía.
Tanto los métodos radiactivos como los de tinción con plata están cayendoen desuso, y en la actualidad son empleados solamente por laboratorios que poseen un escaso volumen de trabajo.
- Sistemas automatizados: son los de última generación, en los cuales al proceso de electroforesis lo efectúa un secuenciador automático, que lee mediante un rayo laser los "primers", marcados con un fluorocromo, adheridos a las zonas variables. Una computadora permite determinar quévariantes son las que se encuentran en cada muestra.


3- Interpretación de los resultados
Según las metodologías empleadas, los resultados se visualizan como "bandas" (en los formatos radiactivos o de tinción) o como "picos" en un gráfico (sistemas automatizados). Dado que la interpretación es idéntica, en los ejemplos utilizaremos los gráficos obtenidos de un secuenciador automático....
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