Comportamiento de la ureasa y su actividad metabólica

Comportamiento de la Ureasa y su actividad enzimática

Emilio Céspedes
1er año Facultad de medicina CLAEH





Resumen
Este informe se centra en el estudio del comportamiento enzimático de la Ureasa. A través de técnicas colorimétricas de espectrofotometría y conocimientos teóricos sobre cinética enzimática se describe brevemente la actividad de la Ureasa, en especial la velocidadde reacción, concentración de amoníaco y los parámetros cinéticos Kcat y Km. Se comprueba efectivamente que dicha enzima es Michaeliana observándose una relación directa entre la cantidad de enzimas y la cantidad de sustratos hasta el punto de saturación. Cuanto mayor absorbancia, mayor la concentración de amoníaco y por consiguiente, mayor la velocidad inicial de la reacción.
Palabras clave:ureasa, actividad enzimática, Michaelis – Menten, espectrofotometría, parámetro cinéticos.

Objetivos
1- Medir la velocidad de reacción enzimática de la ureasa.
2- Determinar la concentración de un producto por técnicas colorimétricas.
3- Obtener los parámetros cinéticos kcat y KM de la enzima ureasa.


Marco Teórico
Para comenzar podríamos definir que es la urea.
La urea es elresultado final del metabolismo de las proteínas. Se forma en el hígado a partir de la degradación de tales macromoléculas orgánicas, y es excretada por la orina a través de los riñones.
Como el nombre lo indica la ureasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de la urea, dando como resultado dióxido de carbono y amoníaco. La ureasa posee una cinética enzimática que corresponde al ModeloMichaeliano (es decir que la enzima conforma un complejo reversible con su sustrato, también conocido como complejo [ES], o complejo de Michaelis).


Urea + H2O Ureasa NH4 + CO2

El amoníaco reacciona con el fenol e hipoclorito de sodio en un medio alcalino produciendo azul de indofenol que puede ser observado en estudios de espectofotometría.NH4 + Fenol + NaClO4 OH- Azul Indofenol

Este método, permite medir la absorvancia del sustrato y permite de esa forma, calcular su concentración en la solución (ya que la concentración de sustrato es directamente proporcional a la cantidad de luz que es absorbida y por lo tanto, también lo es la densidad del color que es expresado).


Materiales
Soluciónestándar de urea 500 mM en agua destilada.
Solución de ureasa comercial de uso clínico.
Reactivo 1: solución acuosa de fenol y nitroferricianuro de sodio.
Reactivo 2: solución acuosa de hipoclorito de sodio e hidróxido de sodio.
Instrumental general de laboratorio (pipetas graduadas, micropipetas automáticas, probetas graduadas, tubos de vidrio, pera de goma, vasos de bohemia, etc.)
Bañotermostatizado a 37 º C.
Espectrofotómetro.
Método
1. Calculamos la concentración de NH4 observada en cada tubo a través de la fórmula de la Ley de Beer: ;
donde A= absorvancia; ; [sustancia] = Concentración de NH4.
Las absorvancias (A) de cada tubo fueron medidas con el espectrofotómetro.

Ejemplo: Tubo 3
Absorvancia corregida medida (A) = 0,034 (UA)





2. Calculamos la velociad dereacción inicial (Vo) para cada tubo de la siguiente manera:



Ejemplo: Tubo 3





Abajo sigue la Tabla 2, con datos obtenidos y calculados para la reacción catalizada por la ureasa.
TUBO
Abs 540 nm (UA)
Abs 540 nm (UA) corregida
[NH4+] (µM)
V0 (µM\min)
Blanco
0.217
0
-
-
1
0.155
0
-
-
2
0.193
0
-
-
3
0.251
0,034
1,7x10 -6
3,4x10-7
4
0.267
0,05
2,4x10-64,8x10-7
5
0.353
0.136
6,6x10-6
1,32x10-6
6
0.722
0,505
24,6x10-6
5,0x10-6
7
0.792
0.575
28x10-6
5,6x10-6
8
0.765
0,548
27x10-6
5,4x10-6
9
1.136
0,919
44,8x10-6
9x10-6

Procedimiento
1. Prepare una serie de 10 tubos rotulados con distintas concentraciones de urea en agua destilada según se indica en la tabla 1.
2. Rotular 10 nuevos tubos de vidrio de volumen 15 mL y...