Confecci N De Los Capachos


ELABORACION DE CURVA DE CALIBRADO PARA PROTEINAS


I. MARCO TEORICO
Es una técnica sensible que consiste en la medición de la extinción provocada por el cambio en el espectro visible de un colorante (Coomasie Blue G-250) cuando éste se une a las proteínas (absorbiendo así a 595 nm). Esta unión se realiza a través de grupos ionizados y se comprueba proporcionalidad con la concentración deproteínas contenidas en la muestra.
La determinación del contenido proteico de una muestra requiere la comparación del valor de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de proteínas, con los que se construye una curva de calibración: a mayor cantidad de proteínas, mayor color desarrollado y por lo tanto, mayor absorbancia. Recordar que esta proporcionalidad essólo lineal hasta un cierto límite de concentración.
Para construir la curva de calibración se requiere contar con un solución testigo de proteína de concentración conocida (generalmente se utiliza albúmina sérica bovina o inmunoglobulina G).

II. INTRODUCCION:

Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas de una muestra, tales como la determinación de la absorbancia a 280nm, o mediante la formación de derivados coloreados de las proteínas, base de los métodos de BIURET o de LOWRY. En estos casos se forma un complejo coloreado de cobre con el enlace peptídico; en el método de Lowry, además del complejo anterior también se forma un derivado de las tirosinas que contribuye a la absorbancia total.
El método que se usó durante esta práctica se basa en un principiodiferente: se emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente.
Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que esrelativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de absorbancia a 595 nm. Para determinar la concentración de proteína total presente en una muestra se requiere la preparación de una curva decalibrado empleando una proteína patrón, que generalmente suele ser la seroalbúmina bovina.


III. OBJETIVO:
Elaborar la curva de calibrado para determinación de proteínas.
Determinar la concentración de proteínas presentes en cada muestra de cultivo al ser comparada con la curva patrón.
Determinar algunas deficiencias de trabajo experimental.





















MATERIALES Y METODOS

CONFECCIÓN DE LOSCAPACHOS
Se corta el papel aluminio de forma cuadrada, de tal manera que pueda cubrir el molde el cual se desea confeccionar.
Luego se coloca encima del molde el papel aluminio que se ha cortado y se empieza a dar forma de éste.
Luego de haberse realizado el moldeado se procede a sacar del molde.
Posteriormente de haber realizado el procedimiento anterior, ya no se puede manipular directamente,sino que debe hacerse por medio de pinzas.





















Método de Bradford
Reactivo: Disolver 0.1 g de azul de Coomassie G-250 en 250 ml de etanol al 98% mas 100 ml de ácido fosfórico al 85% y con H2o destilada aforar a 1 litro




















PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE SALES

Pesar las correspondientes sales que conforman nuestra solución de sales.

Nutriente
Concentración (g/l)Para 500 ml
CaCl2.2H2O
1.12
0.5611
ZnSO4.7H2O
0.11
0.0556
CuSO4.5H2O
0.05
0.0306
CoCl2.6H2O
0.01
0.0252
FeSO4.7H2O
0.06
0.0055
MoO3
0.0005
0.0003
MnCl2.6 H20
0.027
0.0167
NaCl
0.28
0.1402


Se pesará con debido cuidado y se diluira con agua destilada en un vaso precipitado adicionándole 100 ml de agua destilada con la ayuda de un agitador de vidrio.








DIAGRAMAS DE FLUJO













IV....