confeccion de un extendido

CONFECCION DE UN EXTENDIDO PARA COLOREAR
MORFOLOGIA Y AGRUPACIONES BACTERIANAS APARTIR DE CULTIVOS PUROS
TECNICA COLORACION GRAM
FIJAR UN FROTIS
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco.
Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra.
Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que éstatenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa.
Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como producto una espiral en la partemedia de la lámina.
Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre eldorso de la mano..
Preparación del extendido
1. Colocar en cada una de las láminas limpias, secas y desgrasadas, una gota de solución salina utilizando el asa de platino previamente esterilizada.
2. Tomar asépticamente con el filamento una pequeña muestra del cultivo sólido suministrado por el profesor y mezclar con la gota de solución salina para obtener una suspensión. También puedeutilizarse un cultivo líquido, en dicho caso, la muestra se toma con el asa de platino y no es necesario colocar la gota de solución salina.
3. Extender la suspensión con el asa de platino previamente esterilizada y enfriada.
4. Dejar secar la lámina a temperatura ambiente.
5. Fijar la muestra extendida a la lámina utilizando calor.
Esto se logra pasando la lámina varias veces por la llama delmechero (máximo 3 veces). La lámina no debe calentarse mucho y ello se verifica tocando suavemente el dorso de la mano con lámina. El operador debe soportar el calor, sin quemarse.


Tinción de Gram
1. Colocar las láminas extendidas y fijadas en una bandeja adecuada y cubrir su superficie con cristal violeta por un minuto. Lavar con agua destilada y escurrir.
2. Cubrir la superficie de lalámina con la solución de lugol por un minuto. Lavar con agua destilada y escurrir.
3. Colocar cada una de las láminas en posición inclinada y decolorarlas con alcohol a 95° hasta que el color libre deje de salir (aproximadamente 10-20 segundos). Lavar con agua destilada y escurrir.
Este es el paso más importante de la coloración ya que una excesiva adición del alcohol permite la salida delcolorante primario de las células gram positivas.
4. Cubrir las láminas con safranina por 30 segundos. Lavar con agua destilada y escurrir.
5. Secar las láminas utilizando papel absorbente.
TINCIONES DIFERENCIALES
Las coloraciones diferenciales requieren el uso de al menos tres reactivos químicos que se aplican secuencialmente al extendido fijado. El primer reactivo se conoce como coloranteprimario. Su función es la de impartir color a todas las células.
El segundo reactivo es el agente decolorante y para establecer contraste se utiliza como tercer reactivo, un segundo colorante.
1) TINCION DE GRAM
La coloración diferencial más importante utilizada en bacteriología es la tinción de Gram, llamada así en honor al investigador que la desarrolló. Esta coloración divide a las bacteriasen dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas, clasificación es de importancia para la diferenciación e identificación de las bacterias.
La coloración de Gram utiliza cuatro reactivos.
COLORANTE PRIMARIO: CRISTAL VIOLETA: es un colorante básico que tiñe a las células de color violeta.
MORDIENTE: IODURO DE GRAM (LUGOL): Este reactivo forma un complejo insoluble cuando se une al...