cromatografia

Cromatografía de afinidad

ÍNDICE
Introducción
Interacción ligando-afinante
Matrices
Matrices de polisacáridos
Agarosa
Celulosa
Dextrano
Matrices sintéticas
Poliacrilamida
Vidrio
Otros soportes
Hidroxialquilmetacrilato
Copolímeros de etileno
Oxiranos acrílicos
Métodos de activación y acoplamiento
Matrices de polisacáridos
Halidas de cianógeno
Triazinas
Oxidación por periodatoOxiranos
Bizaridinas
Divinil sulfonas
Benzoquinonas
Alógenos
Grupos tioles
Matrices sintéticas
Poliacrilamida
Modificación directa
Aminoetilación
Hidrazinación
Hidrólisis alcalina
Modificación indirecta
Copolimerización
Vidrio
Otras
Brazos espaciadores
Bloqueo de los sitios inactivos
Ligandos
Anexos
Ejemplos prácticos
Bibliografía

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A. Carbajal-Saucedo

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
INTRODUCCIÓN
En 1906 Michael Tswett publicó un arículo donde describe la separación y
purificación de los pigmentos de una planta y estableció la cromatografía como un
método en el cual una mezcla es separada mediante unadsorbente en un sistema
fluido. A partir de entonces y hasta ahora se han logrado separar una enorme cantidad
de macromoléculas mejorando el sistema propuesto por Tswett hace más de 95 años.
Existen varios tipos de cromatografía desarrolladas para diversos propósitos
(Oh-ishi y Maeda, 2002). La cromatografía de exclusión molecular se basa en las
diferencias en pesos moleculares de loscomponentes para separarlos; la
cromatografía de intercambio iónico toma en cuenta las cargas de las moléculas; la de
interacción hidrofóbica se basa en la hidrofobicidad de las partículas a separar; y la
cromatografía de afinidad, tema principal de este trabajo, retrasa la elución de alguna
macromólecula específica mediante la unión de ésta con un ligando particular
La cromatografía de afinidad sebasa en la interacción, específica y reversible,
que se presenta entre una partícula de interés (llamada genéricamente “afinante”) con
alguna molécula particular que va a ser inmovilizada en un soporte sólido (a esta
partícula se le conoce como “ligando”). La interacción de estas dos moléculas es similar
a la que se presenta entre una enzima y su sustrato. Durante finales de los 60s y
principiosde los 70s se escribieron los primeros trabajos que tomaban en cuenta esta
interacción para separar proteínas específicas.
Cuatrecasas (1969, 1970) y Cuatrecasa et al. (1968) sentaron las bases que son
utilizadas hasta ahora para la purificación de diversos afinantes. En estos artículos se
describen tanto las características que deben presentar los diferentes soportes como
las primerasmetodologías de activación que se usaron para unir el ligando al soporte.
Como se verá a lo largo de este trabajo la cromatografía de afinidad ha sido una
herramienta de enorme importancia para el aislamiento, purificación y caracterización
de diversas macromoléculas. Además, se ha usado ampliamente para determinar
diferentes parámetros que rigen la interacción de dos macromoléculas: constantes deasociación, de disociación, concentración máximas y mínimas de sustratos, entre otras
(Baczek y Kaliszan, 2001, Dunn et al., 1983)

INTERACCIÓN LIGANDO-AFINANTE

La afinidad que tenga un ligando por algún afinante específico es una consideración de
enorme importancia para la correcta selección del ligando a inmovilizar. Un modelo
matemático simple para describir la adsorción de algúnafinante a la columna en

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Cromatografía de afinidad

términos de unos cuantos parámetros medibles puede ser úitl para evaluar el posible
uso de un ligando (Lowe, 1979)
Si la concentración de un afinante la denominamos como E y la del ligando
como L entonces:
KD
E+L
EL
Donde la constante de disociación (K
por

D)

del complejo enzima–ligando (EL) está dada

[E] [L]
KD=
[EL]...