Cromatografia

3.2 FUNDAMENTO DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS.
3.2.1 INSTRUMENTACIÓN BÁSICA.
Cromatógrafo. Equipo instrumental que se utiliza actualmente para realizar una separación y cuantificación mediante cromatografía de elución en columna.
Partes básicas de un cromatógrafo.
1. La fase móvil o eluyente (líquido, gas o fluido supercrítico) que tiene como misión transportar a los componentes de lamuestra a través de la fase estacionaria.
2. El sistema de regulación y medida del flujo o presión de la fase móvil.
3. El inyector o sistema de introducción de la muestra en la corriente de la fase móvil. El proceso de introducción de la muestra en el cromatógrafo comúnmente se denomina inyección.
4. La columna cromatográfica, tubo estrecho generalmente de metal o sílice fundida, condiámetro interno y longitud variables, en cuyo interior se encuentra la fase estacionaria. Es, por tanto, en su interior donde los componentes de la muestra se separan. La columna puede unirse directamente al inyector y al detector (cromatografía de gases, GC) o bien estar conectada a otras partes del equipo mediante tubos conectores (cromatografía de líquidos de alta eficacia, HPLC).
5. Un sistemade termostatización que permite mantener la temperatura de la columna constante.
6. El detector, que es la parte del instrumento que mide de manera continua una propiedad física o química del fluido que sale de la columna (eluato) y la transforma en una señal eléctrica.
7. Un sistema de amplificación y tratamiento de la señal eléctrica generada por el detector, de manera que se obtengauna señal que pueda ser entendida por el analista (por ejemplo, la aparición del cromatograma en la pantalla del ordenador.

Fig. 1 Esquema de la instrumentación básica en un cromatógrafo.
3.2.2 TEORÍA CROMATOGRÁFICA.
Elución. Proceso mediante el cual la fase móvil pasa continuamente a través de la fase estacionaria, en la cual se introduce la muestra en una cantidad conocida.

Fig. 2 Esquemadel principio de Elución.
Principio Cromatográfico. Los diferentes componentes de la muestra, en función de las diferentes afinidades que presentan por ambas fases, se mueven a diferentes velocidades y eluyen, por tanto a diferentes tiempos. Así los componentes con mayor afinidad por la fase estacionaria quedarán retenidos durante más tiempo, por lo que tardarán en eluir más que aquelloscomponentes que presentan menor afinidad por dicha fase. Esta diferencia de afinidad ocasiona que los componentes se separen en bandas diferenciadas que al pasar por el detector, den una señal que se registra en forma de bandas o picos.
Cromatograma. La representación gráfica de la señal obtenida en función del tiempo (o volumen) de elución.

Fig. 3. Ejemplo de Cromatograma
Como se puede observar enla figura 3, los picos cromatográficos se pueden asemejar a curvas gaussianas o de distribución normal. Esto es debido a que cuando las distintas moléculas de un mismo analito se mueven por la columna, no todas se mueven con la misma velocidad, si no que se produce una dispersión simétrica de las velocidades alrededor de un valor medio, el cual representa el comportamiento más frecuente de lasmoléculas (máximo del pico). Además la anchura de las bandas aumenta a medida que éstas se mueven por la comuna, de manera que cuanto más tiempo tarde en salir un analito de la columna mayor dispersión se producirá en la velocidad de las moléculas del analito y mayor ensanchamiento de la banda.
3.2.2.1 PARÁMETROS RELACIONADOS CON LA RETENCIÓN DEL ANALITO.
Un cromatograma aporta una serie deparámetros importantes relacionados con la retención del analito.
Tiempo de retención (tr). Es el tiempo que transcurre desde el momento en que el analito entra en el sistema cromatográfico (inyección) hasta el momento en que el la mayoría de las moléculas de ese analito (que viene representado por el máximo de banda) alcanzan el detector.
C
tm
A
B

Fig. 4. El tiempo de retención del compuesto...