Cromatografia

Cromatografia de tamizado molecular
La cromatografía de tamizado molecular es un método útil para aproximar el tamaño y peso molecular de las proteínas. El fraccionamiento se basa en la difusión diferencial de las moléculas en los poros del gel. Las proteínas con masas moleculares altas no pueden entrar en los poros del gel, por lo que son eluídas a través del volumen de exclusión de lacolumna, y lo hacen mas rápido que las moléculas de masa molecular menor. De esta manera, las moléculas eluyen de la columna en orden decreciente de peso molecular. Esto no es realmente cierto, aunque sí una buena aproximación. Las moléculas se eluirán de la columna no solo según su peso molecular, sino también según su radio de Stokes (que da idea de la esfericidad de la molécula). La aproximaciónes válida si se tiene en cuenta que los enzimas (moléculas con los que generalmente se trabaja) son aproximadamente esferoides.
Para determinar el peso molecular de una proteína desconocida se recurre al índice de Kovacks; éste índice no es mas que la razón existente entre la diferencia entre el volumen de elución de la proteína problema y el volumen de exclusión o intersticial de la columna, yel volumen de poro de la matriz:
 
|Kd = Ve - Vz / Vp |


 
donde Kd: índice de Kovacks,
Ve: volumen de elución de la proteína problema,
Vz: volumen intersticial, y
Vp: volumen del poro.
El volumen intersticial lo indica alguna molécula de alto peso molecular; se utilizaazul dextrano, polisacárido de masa molecular aproximada 2.000 kDa. El volumen de poro es la diferencia entre el volumen total y el volumen de exclusión: para calcular el volumen total se añade a la muestra una molécula de bajo peso molecular, que puede ser el cromato potásico (194,2 Da). El índice de Kovacks (Kd) obtenido para una determinada proteína se ha de incluir en una recta de regresióncalculada con proteínas patrones, de peso molecular conocido, representándose Kd vs. log masa molecular.
Existen multitud de matrices para realizar este tipo de cromatografía. Su elección dependerá de la resolución requerida y del peso molecular de las moléculas a fraccionar. El Sephadex es una de las matrices que primero se han empleado. Se trata de perlas de un polímero polisacáridopreparado con diferentes tamaños de poro: G-10, G-25, G-50, G-75, G-100 y G-200. La primera de ellas se emplea para desalar muestras porque el diámetro de sus poros solo permite el paso de moléculas pequeñas (no más de 1.000 kDa); la última permite la separación de moléculas de masa molecular entre 500 y 5 kDa. Este tipo de matriz está disponible en dos formas: coarse y fine, la primera permite flujossuperiores, pero la resolución obtenida es menor. Con todo, la resolución posible con este tipo de matriz es pobre. Para mayor resolución se emplean matrices con mejores propiedades de flujo y resistencia a la presión, ésto se ha conseguido sacando al mercado matrices de diversa composición, y mejorando la estructura de las perlas de dichos geles.Así, Sepharose (polisacárida) es similar Sephacryl(polímero de un polisacárido y bis-acrilamida), y ambas permiten mayor resolución que Sephadex, siendo Superose y Superdex (polisacáridas) las mejores.
La resolución en cromatografía es crítica. Una columna con gran resolución es una columna que soporta un gran número de platos teóricos por metro. Un plato teórico es el volumen requerido por una molécula para establecer un equilibrio entre ella, lamatriz y la fase móvil en el sistema. Actualmente, las columnas con mayor número de platos teóricos son las de Superdex HR (pueden llegar a 30-40.000 platos teóricos por metro). También son importantes las dimensiones de la columna cromatográfica, a mayor longitud, mayor número de platos teóricos, por lo tanto mayor resolución (pero ojo, la muestra puede quedar muy diluida, lo que disminuye la...