Cromatografia

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL.
Filtración en gel: En esta las moléculas son separadas por su tamaño. El gel consiste de una cama de esferas con poros de un tamaño dado. El gel se conoce como sefadex, el cual viene con poros de distintos tamaños. Las moléculas de igual o menor tamaño que el poro entran a las esferas mientras que las moléculas más grandes pasan rápidamente por la columna. Lasmoléculas de tamaño intermedio pueden entrar las esferas pero pasan menos tiempo en ellas. Las moléculas salen en orden de tamaño por el eluído. Aunque para efectos de este laboratorio las muestras que usaremos están coloreadas, al hacer esta cromatografía en la vida real hay que usar otras pruebas para determinar qué fracciones contienen las muestras de interés, las cuales suelen ser proteínas.Estas pruebas pueden ser mediciones fotométricas, SDS-PAGE o ensayos enzimáticos. Una vez tenemos identificadas las fracciones con las muestras,podemos hacer un "profile" de elución con concentración en con concentración en Y y el volumen de elución en X. El volumen inicial es el "void volume" de la columna. Lo que contiene es en amortiguador que estaba dentro de la columna al empezar. Lasmoléculas más grandes salen inmediatamente después.

Principios.
No requiere la unión de la proteína, lo cual reduce significativamente la posibilidad de perder la proteína por una unión irreversible o bien por inactivación de la misma.
Separa las proteínas de acuerdo a su tamaño.

Usos.
a. Purificación de proteínas.
- Se puede utilizar como una etapa de purificación de proteínas.
-Este tipo de cromatografía es complementario a la de intercambio iónico.
- Se basan en principios diferentes (carga y tamaño).

b. Determinación del peso molecular
- Se puede tener una estimación del peso molecular de una proteína.
- La estimación del PM supone que las proteínas son globulares. (Estándar de PM son proteínas globulares).
- El PM de una proteína fibrilar puede ser mayor si noentra en los poros o menos si accede a ellos.
- Una forma de evitar el problema de la geometría es tratar la muestra con un agente denaturante (guanidina o urea).

c. Remoción de impurezas de bajo PM.
Remoción de isótopos de bajo PM.

d. Separación de monómeros, dímeros u otros oligómeros.

e. Cambio de buffer de una proteína.
Es un método suave y rápido para transferir una proteína deun buffer a otro.
También se usa para desalar una muestra, es decir pasarla de un buffer de alta fuerza iónica a uno de baja fuerza iónica.

f. Estudios de unión proteína-ligando.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

La cromatografía de intercambio iónico (o cromatografía iónica) es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en las propiedades de carga delas moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada, incluyendo grandes proteínas, pequeños nucleótidos y aminoácidos. La solución que debe inyectarse es usualmente llamada "muestra" y los componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificación de proteínas, análisis de agua o control de calidad.
Principios
La cromatografía deintercambio iónico conserva los analitos basandóse en las interacciones de Coulomb. La fase estacionaria muestra en la superficie grupos funcionales iónicos que interactúan con iones de carga opuesta del analito. Este tipo de cromatografía se subdivide a su vez en la cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico:
* La cromatografía de intercambio catiónico retienecationes cargados positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado negativamente, como un ácido fosfórico
* La cromatografía de intercambio de aniones retiene aniones usando grupos funcionales cargados positivamente, como un catión de amonio cuaternario.
R-A-H+ + M+ + B- <--> R-A-M+ + H+ + B-
Separacion de proteínas
Las proteínas tienen numerosos...