Desintegración De Tejidos, Células Y Orgánulos

TEMA 1. DESINTEGRACIÓN DE TEJIDOS, CÉLULAS Y ORGÁNULOS. FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR Y CENTRIFUGACIÓN. ENZIMAS MARCADORES. CENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA Y PREPARATIVA. * DESINTEGRACIÓN DE TEJIDOS, CÉLULAS Y ORGÁNULOS. * INTRODUCCIÓN. Cuando aislamos un tejido, sus células poseen una cantidad mínima de enzimas y compuestos que no se excretan y necesitamos hacer la desintegración del tejido y de lascélulas para poder aislarlos y estudiarlos. Para observar lo que hay en el interior de la célula tenemos que romperla, pero no basta con esto pues hay compuestos unidos a la membrana, de manera que por centrifugación podemos precipitarlos y obtener los distintos componentes. También existen tampones que incluyen detergentes; los más conocidos son los detergentes no iónicos del tipo TRITÓN x100 o TRITÓNx114. También existen sales biliares que son compuestos hidrofóbicos que extraen los componentes de la membrana. En algunos casos los que interesa es romper la célula pero no los orgánulos, es lo que se llama fraccionamiento subcelular, y mantiene intactos los orgánulos. * MÉTODOS DE RUPTURA DEL TEJIDO. * FÍSICOS: * Trituradosres (minipimer) * Picadores. * Batidoras como el politrón que es unabatidora con un cilindro que está relleno y al final lleva un espacio vacío con astas de cuchillas. * Los tejidos más consistentes como la epidermis de rana, se rompen con abrasivos en un mortero con arena de mar, el resultado se somete a centrifugación, donde precipita el resto del tejido y en la suspensión se nos queda la muestra. * Fuerzas de cizalla (máquina de taladrar); se usa un homogenizadorpotter que tiene un émbolo que encaja perfectamente en el tubo, la fuerza generada por el émbolo en el tubo hace que se rompan las células. *Ultrasonización: rompe las células de procariotas de bacterias y de levaduras, se mete una varilla que genera ultrasonido, se producen burbujas de vacío llamadas de cavitación. La variación de presión externa generada 1

por las burbujas hace que lascélulas se rompan. * NO FÍSICOS: * Tratamientos térmicos. * Congelación−descongelación (formación de cristales). * Desecación; pérdida de presión que provoca un intento de salida por el agua que provoca la ruptura de la célula. * Choque osmótico. * Enzimas líticas que atacan a la membrana celular. * Tratamientos ácidos extremos o alcalinos extremos; aunque este método no es bueno. * FRACCIONAMIENTOSUBCELULAR Y CENTRIFUGACIÓN. Se usa en el caso de querer romper las células pero los orgánulos queremos obtenerlos intactos y por separado. Por ejemplo la extracción de enzimas mitocondriales, ADN del núcleo... Con este fundamento se obtienen 5 fracciones fundamentalmente. Ejemplo: tenemos un hígado de ratón y queremos romper los hepatocitos pero no los orgánulos. * 1º Homogenización del tejido. *Para ello por ejemplo usamos un potter. * Obtenemos una mezcla roja en un tampón poco drástico. * El tampón lleva: * Sales adecuadas para no romper los orgánulos como puede ser el TRIS clorhídrico a pH 7. * Sacarosa 0,5 M que rompe la membrana plasmática pero no los orgánulos. * Sales de cloruro de magnesio por que las mitocondrias necesitan del ión Cl− para mantener la integridad. * Con lahomogenización obtenemos una mezcla viscosa, en estado de semigel. * 2º centrifugación a 2500 rpm durante 10 min. 1º precipitado que tiene partículas de mayor peso y volumen como son los núcleos. 2º sobrenadante con el resto de orgánulos. * 3º sobrenadante se centrifuga a 9300 rpm durante 10 min: 1º precipitado con mitocondrias (2º orgánulo de mayor volumen de la célula).

2

2º sobrenadante con elresto de componentes celulares. * 4º centrifugación a mayor velocidad, 13000 rpm durante 15 min. 1º precipitado que contiene a los lisosomas. 2º sobrenadante que contiene todos los componentes no separados anteriormente. * 5º ultracentrifugación: 33000 rpm durante 60 min. 1º precipitado compuesto por microsomas que son las fracciones de RE, Golgi ... 2º sobrenadante: es la fracción soluble del...