escrutinio de bibliotecas

El escrutinio de bibliotecas genómicas tiene un fin principal, poder elegir a las clonas que poseen el fragmento genómico de interés, ya sea por medio de una secuencia o proteína expresada. Paralograr esto existen dos técnicas principales: por hibridación de sondas de ácidos nucleicos o por anticuerpos (expresión de proteínas). Estas técnicas son muy utilizadas y de alto interés ya que nospermiten analizar a todas las clonas y discriminar a las que no contienen el gen. Que método utilizar dependerá de si se conoce la secuencia y no el producto, o si se conoce el producto mas no lasecuencia.
La hibridación de sondas de ácidos nucleicos es una técnica de escrutinio enfocada al reconocimiento de la secuencia de interés por medio de la hibridación con una sonda. Una sonda de hibridaciónes una secuencia de DNA o RNA en algunos casos de entre 100 y 1000pb que contiene una secuencia similar a la complementaria. Estas sondas pueden estar marcadas radioactivamente o no.
La metodologíapara el escrutinio es:
1. Placa de lisis. Se preparan cajas con agar y medio LB. Por otra parte se obtiene un cultivo de E. coli infectada con los fagos que contienen la biblioteca a este se le agregaagarosa derretida. Se vierte el cultivo en la caja y se incuba.
2. Transferencia. Terminada la incubación se coloca una membrana de nylon o nitrocelulosa sobre esta con el fin de obtener una réplicade la caja. La membrana es tratada con NaOH y NaCl para desnaturalizar el DNA y se seca con luz UV para fijarlo.
3. Bloqueo. Se incuba la membrana con la solución de hibridación (detergentes, BSA ysemen de salmón) para minimizar la unión no específica.
4. Hibridación. En una bolsa se coloca la membrana con la solución que contiene a la sonda de ácidos nucleicos. Para evitar el exceso de señalse realizan lavados de astringencia (SSC y temperatura). Estos permitirán eliminar las hibridaciones parciales (con secuencias homologas).
5. Revelado. La membrana es colocada en una placa de rayos...