Espectrofotometría En El Laboratorio De Análisis Clínicos

ESPECTROFOTOMETRÍA

I- NATURALEZA DE LAS RADIACIONES ELECTROMAGNÉTICAS
II- ABSORCIÓN DE LA LUZ: LEY DE LAMBERT-BEER
III- ESPECTROS DE ABSORCIÓN
IV- INSTRUMENTACIÓN EN ESPECTROFOTOMETRÍA UV-V
IV.1.- COMPONENTES
IV-2.- TIPOS DE ESPECTROFOTÓMETROS
V- CÁLCULOS EN LAS TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS
VI- CONTROL DE CALIDAD

I- NATURALEZA DE LAS RADIACIONES ELECTROMAGNÉTICAS
Las REM secomportan como ondas y como partículas. Como ondas, cada REM se define según estos parámetros:
- Longitud de onda: λ . Se mide en nm.
- Frecuencia: ν = c/λ . Se mide en ciclos o hertz = s-1 .
La energía de cada radiación es: E = h·ν . h= 6´62 · 10-27 erg/s
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El espectro electromagnético es el conjunto de las REM. Estas se pueden agrupar en regiones, que son intervalos delongitudes de onda. Las que más interesan en el laboratorio son las regiones ultravioleta (220-390 nm) y visible (390-700 nm).
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Cada longitud de onda de la región visible corresponde a un color determinado. No hay límites definidos entre colores contiguos, sino una variación gradual a lo largo de todo el espectro.
Los colores que el ojo humano percibe se producen por dos maneras distintas:
-por adición
- por sustracción o absorción selectiva
En las soluciones coloreadas, se absorben una serie de radiaciones y se transmiten otras, que son las complementarias. El color percibido es el de las radiaciones complementarias a las absorbidas.

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II- ABSORCIÓN DE LA LUZ: LEY DE LAMBERT-BEER
Cada REM monocromática que incide sobre la superficie de una sustanciahomogénea, puede sufrir varios procesos, que tendrán mayor o menor intensidad según las características de cada sustancia. I0 = Ia + It + Ir

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El efecto de la reflexión se corrige en la mayoría de los espectrofotómetros con los que se trabaja, por lo que se puede simplificar la expresión anterior en: I0 = Ia + It
La única luz medible es la que se transmite.
La absorbancia A es unamagnitud que mide la capacidad de absorber radiación de una muestra a través de la siguiente relación:
A = log (Io / I)
Asociada a ella, en ocasiones se usa la transmitancia T. T = I/Io
La relación entre ambas magnitudes es: A = log (1/T) = -log T

Transmitancia T = It /I0.
%T= It /I0 X 100
A = - logT = 2 - log%T


Ley de Lambert-Beer: A = abc = - logT
A: absorbancia.
a:absortividad. Cuanto mayor sea la absortividad de una sustancia determinada, mayor absorbancia para una determinada concentración y, por tanto, mayor sensibilidad.
b: longitud de la capa atravesada. Se expresa en cm
c: concentración de la sustancia absorbente.

La absorbancia está en relación lineal y directa con la concentración de la sustancia absorbente, mientras que la transmitanciaestá en relación logarítmica inversa.


III- ESPECTROS DE ABSORCIÓN
Absorbancia típica para cada sustancia en cada longitud de onda. La representación gráfica de la relación entre la absorbancia producida con cada longitud de onda se llama espectro de absorción (X: longitudes de onda, Y: absorbancia).








Utilidades:
- seleccionar la λ de máxima absorbancia, para medir laconcentración de esa sustancia con el espectrofotómetro
- identificación cualitativa de sustancias













ESPECTRO DE EMISIÓN:
Algunas sustancias emiten energía radiante a una longitud de onda determinada. Podemos analizar esta radiación emitida y registrarla mediante un espectro de emisión. Esto es el principio de la fotometría de emisión, cuyos 2 tipos principales son lafotometría de llama y la fluorometría.











IV- INSTRUMENTACIÓN

La espectrofotometría de absorción es la medida de la radiación que llega a un detector tras producirse un fenómeno de absorción de luz por parte de una sustancia absorbente. Lógicamente, la luz detectada es la complementaria de la absorbida, por lo que se detecta It. Sin embargo, el instrumento permite calcular...